一种透明质酸裂解酶及其在降解透明质酸中的应用

本发明涉及一种透明质酸裂解酶及其在降解透明质酸中的应用，属于酶工程。

背景技术：

1、透明质酸(hyaluronan或hyaluronic acid，ha)，俗称玻尿酸，是一种由d-葡萄糖醛酸和n-乙酰氨基葡萄糖为重复双糖单位，通过β-(1，3)和β-(1，4)糖苷键交替连接而成的大分子酸性黏多糖。透明质酸具有的亲水性、粘弹性与生物相容性使其被广泛关注并应用于医药、美妆、食品等领域。

2、近年来研究发现相对分子质量较小的透明质酸(ha)，尤其是o-has(相对分子质量小于10k的寡聚糖)具有很重要的生物功能，如o-has具有促血管生成作用，促进伤口修复、抑制肿瘤细胞多药耐药性等作用，在医药、化妆品和保健品中具有潜在的应用价值。寡聚糖ha(o-has)和ha片段(≤2×104da)都显示了抗炎和促炎特性，这取决于细胞类型和疾病。一些研究表明，o-has能够减少toll样受体(tlrs)介导的炎症性，抑制ha-cd44对激酶的激活，并延缓肿瘤的生长。然而，o-has也被发现可以促进滑膜成纤维细胞的炎症，刺激细胞粘附，增强血管生成。不饱和透明质酸二糖展现出独特的抗炎活性。因此，制备特定分子量的透明质酸有着重要意义。

3、透明质酸酶(hyaluronidase，haase)可以将透明质酸降解为o-has，是制备o-has最为重要的方法。关于透明质酸酶的研究已逐渐成为热点，透明质酸酶广泛分布于自然界生物体中，在哺乳动物、无脊椎动物(甲壳类、水蛭和昆虫)、病原真菌(念珠菌、链霉菌)、细菌和噬菌体中都有发现。目前已发现多种微生物能够产生透明质酸酶，大多集中在节杆菌(arthrobacter)、巴斯德杆菌(pasteurella)、兽疫链球菌(streptococcuszooepidemicus)、芽孢杆菌(bacillus)等。目前已知的所有微生物来源的透明质酸酶都属于裂解酶，能降解透明质酸的β-(1，4)糖苷键，形成含不饱和双键的寡糖。与动物来源的酶相比，微生物来源的酶有产量高、活力强、性质多样、易于异源重组表达等特点，是工业酶制剂的主要研究对象。

4、目前市售的透明质酸酶大都是从动物组织中提取出来的，成本高技术也相对较复杂，所以还需要尽快明确微生物产透明质酸裂解酶的特点以及了解微生物来源的透明质酸裂解酶的性质，进而获得更多安全的、性质优良的透明质酸酶。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供了一种来源于肠杆菌(enterobacter asburiae)的透明质酸裂解酶，该酶在大肠杆菌中重组表达的酶活高达36715u/ml，对底物透明质酸具有高度选择性和良好的催化性能，在降解透明质酸生成寡聚糖如透明质酸二糖中表现优异，在降解速度上优于现有报道的透明质酸裂解酶。

2、本发明的第一个目的是提供一种透明质酸裂解酶，所述透明质酸裂解酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。

3、本发明的第二个目的是提供编码所述透明质酸裂解酶的基因。

4、进一步地，所述基因的序列如seq id no.2所示。

5、本发明的第三个目的是提供携带所述基因的重组表达载体。

6、本发明的第四个目的是提供含有所述基因的表达框。

7、进一步地，所述表达框包括表达所述基因必要的原件和/或辅助表达的原件，如启动子、终止子、信号肽、rbs等。

8、本发明的第五个目的是提供表达所述透明质酸裂解酶的重组菌。

9、进一步地，所述重组菌的宿主菌包括大肠杆菌。

10、本发明的第六个目的是提供一种生产透明质酸裂解酶的方法，包括采用所述重组菌进行发酵生产的步骤。

11、进一步地，在发酵生产过程中，ph优选为7.0-8.0，温度优选为20-40℃。

12、进一步地，在发酵生产过程中，种子培养基或发酵培养基为lb培养基。lb培养基中包括：8-12g/l胰蛋白胨，3-7g/l酵母粉，8-12g/l氯化钠。

13、本发明的第七个目的是提供所述透明质酸裂解酶在降解透明质酸中的应用。

14、进一步地，所述透明质酸为高分子量透明质酸和/或中等分子量透明质酸，如分子量为1000-2000kda，更优选为1000-1500kda。

15、进一步地，所述应用是在短时间内(如30min、40min、50min、1h、2h、3h、4h、5h、6h或高于6h的任何时长)将高分子量透明质酸或中等分子量透明质酸降解为低分子量透明质酸或寡聚透明质酸，优选地，平均分子量低于20kda、低于10kda、低于5kda、低于1kda甚至低于500da。

16、进一步地，降解透明质酸的条件为：反应温度25-45℃、反应ph 6.5-9.0、透明质酸浓度1-20g/l。

17、本发明的第八个目的是提供一种生产低分子量透明质酸或寡聚透明质酸的方法，包括以高分子量透明质酸或中等分子量透明质酸为底物，以所述透明质酸裂解酶为催化剂进行制备的步骤。

18、进一步地，反应时间至少1h。更优选地，至少2h。

19、进一步地，所述寡聚透明质酸包括但不限于透明质酸二糖、透明质酸四糖、透明质酸六糖、透明质酸八糖、透明质酸十糖、透明质酸十二糖等。

20、本发明的有益效果：

21、本发明提供了一种透明质酸裂解酶及其在降解透明质酸中的应用，其中的透明质酸裂解酶来源于肠杆菌(enterobacter asburiae)，本发明通过克隆其编码基因并在大肠杆菌体系实现了重组表达，酶活达到36715u/ml，蛋白分子量为87.88kda。酶学性质表征实验表明该酶能够在ph 6.5-9.0范围内发挥透明质酸降解作用，最适ph为7.0，最适反应温度为40℃。更重要地，该酶对透明质酸有着较高的底物特异性，且降解效率高，100u/ml的酶在1h即可将平均分子量1360kda的透明质酸降至20kda以下，最终的降解产物为不饱和透明质酸二糖。本发明提供的透明质酸裂解酶可以高效的生产不饱和透明质酸二糖。

1.一种透明质酸裂解酶，其特征在于，所述透明质酸裂解酶的氨基酸序列如seq idno.1所示。

2.编码权利要求1所述透明质酸裂解酶的基因。

3.携带权利要求2所述基因的重组表达载体。

4.含有权利要求2所述基因的表达框。

5.表达权利要求1所述透明质酸裂解酶的重组菌。

6.一种生产透明质酸裂解酶的方法，其特征在于，包括采用权利要求5所述重组菌进行发酵生产的步骤。

7.权利要求1所述透明质酸裂解酶在降解透明质酸中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括采用所述透明质酸裂解酶将高分子量透明质酸或中等分子量透明质酸降解为低分子量透明质酸或寡聚透明质酸。

9.一种生产低分子量透明质酸或寡聚透明质酸的方法，其特征在于，包括以高分子量透明质酸或中等分子量透明质酸为底物，以权利要求1所述透明质酸裂解酶为催化剂进行制备的步骤。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述寡聚透明质酸包括透明质酸二糖、透明质酸四糖、透明质酸六糖、透明质酸八糖、透明质酸十糖或透明质酸十二糖。