一种人血液中肿瘤细胞的捕获筛网的制作方法

本发明属于生物医学工程，更具体地说，特别涉及一种人血液中肿瘤细胞的捕获筛网。

背景技术：

1、肿瘤是一种基因病，但并非是遗传，它是指细胞在致癌因素作用下，基因发生改变，失去对其生长的正常调控，导致单克隆性异常增生而形成的新生物，目前，肿瘤检测方法主要有影像检查，超声，磁共振，核医学，血液检查等，其中血液检查是体检中查出早期癌症的重要手段，检测血液中各种肿瘤标志物指标是否升高，则可发现、鉴别各种恶性肿瘤，研究还发现，肿瘤细胞可以从实体肿瘤中脱落、侵袭、进入血液循环是实现肿瘤远处转移，这和肿瘤的进展和复发有着密切的联系，所以对血液中肿瘤细胞检测有助于肿瘤转移患者的诊断、监测术后患者肿瘤的复发、评估抗肿瘤药物的敏感性与患者预后等，所以本研究根据不同细胞大小拟开发一种在血液中捕获肿瘤细胞的筛网芯片，可实现对血液中肿瘤细胞的捕获和检测。

2、目前，不管采用哪种技术对肿瘤进行诊断均存在无法解决的劣势：

3、1、影像学评估是一种无创性的评估，但需要肿瘤达到一定体积以及较高的分辨率，难以发现特别小的病灶，且需要动态监测。

4、2、超声主要用超声波探查人体，其不能用于头颅和肺的肿瘤检查，对于腹部和盆腔易受肠道气体的影响造成诊断上的困难。

5、3、血清学检测，如标志物检测，但标志物检测的特异性并不强，并不是所有肿瘤患者标志物都会升高。

6、4、病理学活检主要弊端在于病理标本取样难，如肠镜的标本、肝脏病灶的穿刺标本等，进行肿瘤评估的患者需多次进行取样，会面临有创的操作，受到一些创伤，也会增加花费，另外，病理检测等待时间长。

7、为此本发明根据不同细胞大小拟开发一种在血液中捕获肿瘤细胞的筛网芯片，可实现对血液中肿瘤细胞的捕获和检测，实现对肿瘤的早期辅助诊断及治疗预后的监测，以期达到更具有更加实用价值的目的。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供一种人血液中肿瘤细胞的捕获筛网，以解决上述的问题。

2、一种人血液中肿瘤细胞的捕获筛网，包括筛网本体，根据不同大小尺寸的细胞，使用物理法对大尺寸的细胞进行捕获，去除小尺寸的细胞，并使用免疫染色法对捕获的细胞进行染色，判断是否为肿瘤细胞，使用孔径为13—20μm、厚度为10—30μm，线径为5—10μm的筛网本体对肿瘤细胞进行捕获，使用乳腺癌sk-br-3、mcf-7、mda-mb-231细胞对筛网本体进行捕获率测试，使用肠癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等癌种对筛网本体进行临床一致性测试，抽取4ml人外周血于凝管中，并2-8℃保存备用。

3、优选的，将4ml外周血从抗凝管中转移到15ml离心管中，加入4ml pbs对血液进行1：1稀释并充分混匀，取4ml淋巴细胞分离液于新的15ml离心管中，将稀释的血液转移至离心管中。

4、优选的，使用水平离心机室温，2500rpm，离心20min，离心结束后，使用移液器垂直小心吸取血浆层，吸取pbmc层于15ml离心管中，并加入10ml pbs洗一次，室温1500rpm，离心5min，离心后，弃上清，加入300μl pbs对pbmc进行重悬备用，临床样本直接进行加样上机检测。

5、优选的，使用移液器将细胞混合液全部置于上样孔中，使用汇先医药2000全自动加样仪对肿瘤细胞进行捕获和染色，仪器运行结束后，使用荧光显微镜对捕获细胞进行计数，并计算捕获率。

6、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

7、本发明中，通过使用移液器垂直小心吸取血浆层，后吸取pbmc层于15ml离心管中，并加入10ml pbs洗1次，室温1500rpm，离心5min，离心后，弃上清，加入300μl pbs对pbmc进行重悬备用，临床样本直接进行加样上机检测，整体可以通过精确控制离心速度和时间，减少对细胞的机械损伤，保持细胞的完整性和活性，通过吸取血浆层，去除可能干扰后续实验的血浆蛋白和其他成分，使用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，有效地分离出pbmc，这些细胞对于许多免疫学研究和临床检测非常重要，通过pbs清洗步骤，去除残留的红细胞、血小板以及分离液，减少后续实验的背景噪声。

8、本发明中，通过显微计进行细胞计数，可以准确获取细胞数量，为后续实验提供精确的细胞浓度，通过梯度稀释，可以调整细胞浓度，满足不同实验步骤对细胞数量的需求，将sk-br-3细胞与pbmc混合液混合，模拟体内肿瘤细胞与正常细胞共存的环境，有助于研究肿瘤细胞与宿主细胞的相互作用，肿瘤细胞捕获需要使用移液器将细胞混合液全部置于上样孔中，使用汇先医药2000全自动加样仪对肿瘤细胞进行捕获和染色，提高了实验的重复性和准确性，减少了人为操作的误差，仪器运行结束后，使用荧光显微镜对捕获细胞进行计数，而通过使用荧光显微镜对捕获细胞进行计数，可以直观地观察和分析细胞状态，便于进行定量分析。

9、本发明中，为优化实验条件提供数据支持，采用本发明肿瘤细胞(以乳腺癌sk-br-3细胞为目的细胞)进行捕获率检测，有助于研究乳腺癌细胞的生物学特性和转移机制，检测结果发现，该方法对sk-br-3细胞的捕获率为65％—82％之间，具有较好的细胞捕获效果，该方法适合于高通量实验设计，可以在短时间内对大量样本进行快速分析，通过研究肿瘤细胞的捕获和检测，可以为癌症的早期诊断、疗效评估和预后判断提供实验依据，通过分析不同患者肿瘤细胞的特性，有助于开发个性化的治疗方案，这种方法为肿瘤细胞的研究提供了一个高效、准确、可重复的实验平台，有助于推动癌症研究和临床应用的发展。

10、本发明中，筛网本体材质为镍合金，镍合金具有良好的机械性能和耐腐蚀性，这使得筛网本体在血液等生物液体中具有较长的使用寿命和稳定性，并且镍合金在生物医学领域常用于制造植入物等，具有良好的生物相容性，减少了对血液成分的干扰和患者的免疫反应，还易于清洗和消毒，有助于筛网本体的重复使用和降低交叉感染的风险，筛网本体尺寸的外圈直径为8.8mm，内圈直径6.0mm，这样设计有助于定向捕获，即只捕获特定区域的细胞，这可以用于提高捕获肿瘤细胞的准确性。

11、本发明中，筛网本体厚度为20μm，可以保证过滤的均匀性和一致性，有助于捕获目标大小的细胞，同时允许较小的血细胞通过，这种尺寸和设计的筛网本体可以方便地集成到自动化的血液分析设备中，实现快速、高通量的肿瘤细胞捕获和分析，筛网本体孔径为18μm，筛网本体线径为8μm，这种设计可以提供较高的孔隙率，有助于提高筛网本体的过滤效率，允许血液细胞顺利通过，同时捕获尺寸较大的肿瘤细胞，通过有效捕获血液中的肿瘤细胞，这种筛网本体有助于癌症的早期诊断和治疗监测，与传统的组织活检相比，使用筛网本体捕获ctcs是一种微创或无创的方法，对患者来说更为友好，并且这种筛网本体不仅可以用于临床诊断，还可以在癌症生物学研究中发挥作用，例如研究肿瘤细胞的异质性和转移机制。

1.一种人血液中肿瘤细胞的捕获筛网，包括筛网本体(1)，其特征在于：根据不同大小尺寸的细胞，使用物理法对大尺寸的细胞进行捕获，通过去除小尺寸的细胞，并使用免疫染色法对捕获的细胞进行染色，判断是否为肿瘤细胞；

2.如权利要求1一种人血液中肿瘤细胞的捕获筛网，其特征在于，抽取4ml人外周血于凝管中，并2-8℃保存备用。

3.如权利要求2一种人血液中肿瘤细胞的捕获筛网，其特征在于，将4ml外周血从抗凝管中转移到15ml离心管中；

4.如权利要求3一种人血液中肿瘤细胞的捕获筛网，其特征在于，取4ml淋巴细胞分离液于新的15ml离心管中。

5.如权利要求4一种人血液中肿瘤细胞的捕获筛网，其特征在于，将稀释的血液转移至离心管中。

6.如权利要求5一种人血液中肿瘤细胞的捕获筛网，其特征在于，使用水平离心机室温，2500rpm，离心20min。

7.如权利要求6一种人血液中肿瘤细胞的捕获筛网，其特征在于，离心结束后，使用移液器垂直小心吸取血浆层；

8.如权利要求7一种人血液中肿瘤细胞的捕获筛网，其特征在于，离心后，弃上清；

9.如权利要求8一种人血液中肿瘤细胞的捕获筛网，其特征在于，使用移液器将细胞混合液全部置于上样孔中；

10.如权利要求9一种人血液中肿瘤细胞的捕获筛网，其特征在于，仪器运行结束后，使用荧光显微镜对捕获细胞进行计数，并计算捕获率。