一种大小鼠病毒项多重PCR检测方法与流程

本发明涉及鼠病检测方法，具体为一种大小鼠病毒项多重pcr检测方法。

背景技术：

1、实验动物在生命科学、生物医药、食品等领域有广泛应用，为人类的科学进步和健康生活做出巨大的贡献。而实验动物的质量直接影响上述众多领域实验的准确性，同时也关系到实验动物从业人员和动物实验操作者的健康。根据《实验动物微生物、寄生虫学等级及监测》国标gb 14922-2022的要求，实验动物病原微生物检测包含病毒、细菌和体外寄生虫，其中小鼠肝炎病毒、仙台病毒、肺炎病毒和呼肠孤病毒iii型是实验小鼠较常见的4种易感染病毒。

2、小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,mhv)是一种冠状病毒科rna病毒，具有高度的传染性，实验动物，尤其是免疫缺陷小鼠感染mhv会对免疫系统产生重大而持久的影响，导致其对包括病毒、细菌和寄生虫在内的感染病程加长或导致更严重的感染。

3、仙台病毒(sendai virus,sv)是一种副粘病毒科rna病毒，主要通过气溶胶及呼吸道分泌物传播，具有高度接触传染性。实验动物感染sv后，容易引起细菌继发感染，导致动物死亡且感染sv的实验动物不适用于科学研究。

4、小鼠肺炎病毒(pneumonia virus of mice,pvm)也是一种副粘病毒科rna病毒，实验动物感染后可引起间质性肺炎并伴随有消瘦以及肺功能障碍、寿命缩短等问题。感染pvm的实验动物不适合科学研究。

5、小鼠呼肠孤病毒iii型(reovirus,reo-3)是一种呼肠孤病毒科rna病毒，可通过粪口、口腔分泌物等传播，实验幼鼠感染后表现为发育不良，腹泻等症状。感染reo-3的实验动物会影响细胞因子水平，肿瘤移植和肝功能等科学研究。

6、上述四项病毒的检测主要采用免疫学方法，例如酶联免疫吸附(elisa)和时间分辨免疫荧光(ifa)等。这些方法只能在被感染动物体内产生相应抗体后才能被检测到，而对于周期性病毒，在排毒阶段，体内无抗体产生时很容易造成假阴性结果，荧光定量pcr(real-time pcr)技术是指在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量pcr技术具有通量高、特异性强、灵敏度高、全封闭反应、自动化程度高、速度快等特点，广泛应用于临床疾病诊断、动物疾病检测等多个领域。

7、多重pcr(multiplex polymerase chain reaction,mpcr)也称复合pcr，其基本原理与常规pcr相同，区别在于多重pcr反应体系加入一对以上引物，各对引物分别结合在模板相对应部位，最终扩增出一条以上目的dna片段。多重pcr可同时用于多种病原微生物，与传统pcr相比，多重pcr具有高效、简便、成本低、系统性强等优势，为此，提出一种大小鼠病毒项多重pcr检测方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种大小鼠病毒项多重pcr检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种大小鼠病毒项多重pcr检测方法，包括以下步骤：

3、s1、准备待测样品核酸；

4、s2、准备阴性质控品、阳性质控品和无模版对照；

5、s3、将待测样品核酸、阴性质控品、阳性质控品和无模版对照分别加入至荧光定量pcr反应体系中；

6、s4、在荧光定量pcr仪上进行pcr扩增反应，通过fam/vic/rox/cy5通道检测四种病毒的特异性扩增曲线；

7、s5、根据荧光定量pcr仪的扩增曲线结果，判断待测样品中是否含有病毒。

8、作为优选，上述：在s1中，所述待测样品为实验动物样本提取获得的核酸，实验动物样本包括但不限于粪便、肠内容物拭子、口腔拭子和组织。

9、作为优选，上述：在s2中，所述阳性质控品可以通过扩增获得4种不同荧光标记的扩增曲线，所述阴性质控品为无酶无菌水。

10、作为优选，上述：在s3中，所述pcr扩增反应以rna为模板，加入针对4种病毒的特异性引物和探针。

11、作为优选，上述：所述探针端使用mgb和bhq3猝灭，采用fam/vic/rox/cy5/cy5.5荧光标记；

12、所述pcr扩增反应体系的终浓度组成为：1～10×pcr mix包含taq酶、dntps、tris·cl、氯化钾、硫酸镁和氯化镁。

13、作为优选，上述：在s4中，所述四种病毒为小鼠肝炎病毒、仙台病毒、肺炎病毒和呼肠孤病毒iii型以及小鼠gapdh基因内参。

14、作为优选，上述：所述pcr扩增反应中所用到的引物和探针是针对上述四项病毒核酸片段保守区设计。

15、作为优选，上述：所述pcr扩增反应的终浓度组成为：1～10×pcr mix、0.1～1μm正向引物、0.1～1μm反向引物、0.1～0.5μm探针和1.0ng/μl以上的模版核酸。

16、作为优选，上述：所述荧光定量pcr扩增反应的具体过程为：

17、首先进行92～97℃预变性5～10分钟；

18、然后进入聚合酶链式反应扩增阶段，92～97℃变性10～30s，50～65℃退火及延伸10～30s，并进行35～45个循环。

19、作为优选，上述：在s5中，所述荧光定量pcr结果判读的具体过程为：

20、阳性质控品有扩增曲线且ct值＜35；

21、阴性质控品无扩增曲线或扩增曲线ct值≥35；

22、待测样品gapdh内参基因有扩增曲线且ct值＜35；

23、当待测样品在所检测的不同荧光通道有扩增曲线且ct值＜35时，判定为对应病毒阳性。

24、本发明采用以上技术方案与现有技术相比，具有以下技术效果：

25、一、本发明通过整合小鼠肝炎病毒、仙台病毒、肺炎病毒和呼肠孤病毒iii型的多重荧光定量pcr检测方法，本发明包含实验动物常见的4种病毒，检测效率高，单管反应同时检测上述4种病毒；方便快捷，在2小时内即可完成检测，检测结果具有较好的准确性和重复性，对实验动物病原微生物的检测具有一定的指导意义。

26、二、本发明通过设计针对病毒核酸片段保守区的特异性引物和探针，确保了检测的高灵敏度和特异性。检测灵敏度可以达到30-100个拷贝，样本浓度低至1.0ng/μl，能够准确识别微量的病毒存在，引入小鼠gapdh基因作为内参，通过检测内参基因的扩增情况，可以监控样本核酸的提取质量和pcr反应的有效性，多种浓度组合的引物探针测试，确定了最佳的反应条件，使得pcr扩增效果最佳，进一步提升了检测的准确性，本方法实现了小鼠肝炎病毒、仙台病毒、肺炎病毒和呼肠孤病毒iii型四种病毒的同时检测，大大提高了检测效率。

1.一种大小鼠病毒项多重pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种大小鼠病毒项多重pcr检测方法，其特征在于：在s1中，所述待测样品为实验动物样本提取获得的核酸，实验动物样本包括但不限于粪便、肠内容物拭子、口腔拭子和组织。

3.根据权利要求1所述的一种大小鼠病毒项多重pcr检测方法，其特征在于：在s2中，所述阳性质控品可以通过扩增获得4种不同荧光标记的扩增曲线，所述阴性质控品为无酶无菌水。

4.根据权利要求1所述的一种大小鼠病毒项多重pcr检测方法，其特征在于：在s3中，所述pcr扩增反应以rna为模板，加入针对4种病毒的特异性引物和探针。

5.根据权利要求4所述的一种大小鼠病毒项多重pcr检测方法，其特征在于：所述探针端使用mgb和bhq3猝灭，采用fam/vic/rox/cy5/cy5.5荧光标记；

6.根据权利要求1所述的一种大小鼠病毒项多重pcr检测方法，其特征在于：在s4中，所述四种病毒为小鼠肝炎病毒、仙台病毒、肺炎病毒和呼肠孤病毒iii型以及小鼠gapdh基因内参。

7.根据权利要求6所述的一种大小鼠病毒项多重pcr检测方法，其特征在于：所述pcr扩增反应中所用到的引物和探针是针对上述四项病毒核酸片段保守区设计。

8.根据权利要求7所述的一种大小鼠病毒项多重pcr检测方法，其特征在于：所述pcr扩增反应的终浓度组成为：1～10×pcr mix、0.1～1μm正向引物、0.1～1μm反向引物、0.1～0.5μm探针和1.0ng/μl以上的模版核酸。

9.根据权利要求8所述的一种大小鼠病毒项多重pcr检测方法，其特征在于：所述荧光定量pcr扩增反应的具体过程为：

10.根据权利要求9所述的一种大小鼠病毒项多重pcr检测方法，其特征在于：在s5中，所述荧光定量pcr结果判读的具体过程为：