一株枯草芽孢杆菌TLD4及其在减轻苹果连作障碍中的应用

本发明涉及农业微生物，具体涉及一株枯草芽孢杆菌tld4及其在减轻苹果连作障碍中的应用。

背景技术：

1、苹果连作障碍(ard)是指果园刨除老树后，重新栽植新树时，新植幼树根系发育不良，幼树生长缓慢，植株矮小抗性降低，甚至整株死亡的现象，又称为再植病害或再植障碍(毛志泉等，2015)。研究发现，苹果根系、土壤和微生物相互作用，引起根系微生态环境失调是连作障碍的主要原因。随着连作年限的增加，不仅会降低土壤微生物的多样性，导致病原菌滋生，而且还会改变微生物群落结构。目前生产上克服苹果连作障碍采用的方法主要有土壤熏蒸和轮作，尽管化学熏蒸对病原菌具有广谱杀灭性，但对生态系统的永久性损害使其逐渐被淘汰。轮作等传统农艺措施虽可通过改变宿主减少ard造成的损失，但耗时长，一般轮作时间不能低于3年，在生产中不易推广。因此生物法防治苹果连作障碍成为一种安全、环保且长效的防治措施。

2、枯草芽孢杆菌是生物防治病害的一种重要菌种，目前已有一些用枯草芽孢杆菌防治苹果连作障碍的报道，例如：专利cn 102965314b公开了一株枯草芽孢杆菌菌种y-1，其能在苹果树、杨树、黄瓜、辣椒根际及苹果树体内定殖，对镰刀菌、立枯丝核菌、轮斑病菌等具有广谱抑菌活性。硕士论文“枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)bs-2防治苹果连作障碍的研究”公开了一株紫外灯诱变产生的新菌株bs-2可以防治苹果灰斑病、镰刀菌、灰霉病、褐斑病、轮纹病和斑点落叶病。期刊文章“枯草芽孢杆菌snb-86菌肥对连作平邑甜茶幼苗生长及土壤环境的影响”公开了一株连作生防细菌snb-86，鉴定为枯草芽孢杆菌，snb-86菌肥可以显著促进连作条件下平邑甜茶幼苗的生长，提高连作土壤酶活性，降低土壤中可培养真菌数量，在一定程度上能缓解苹果连作障碍。

3、虽然上述报道的枯草芽孢杆菌对苹果连作障碍有一定防治效果，但是，近期研究发现，ard专化型层出镰孢菌(fusarium proliferatum f.sp.malus domestica)mr5是造成环渤海湾苹果连作障碍的主要病原菌，该病原菌对苹果砧木具有强致病性，目前对该病原菌缺少有效的防治手段。此外，发明人在前期研究发现，在连作苹果园更新前一年连续轮作葱、芥菜和小麦后再种植苹果幼树，能改善植株长势(wang et al.,2021)。在此基础上，进一步施加生物菌剂可能会进一步提高对苹果连作障碍的改善效果。但是，趋化性在根际微生物与根的相互作用中发挥着重要作用，如生物膜形成、根定殖、固氮和致病作用等。植物根系分泌物是植物生长过程中通过根系释放到根际环境中的有机和无机物质的复杂混合物，不同植物的根系分泌物在数量和组成上都不同，相应的，微生物对不同根系分泌物的趋化性存在差异。由于在连作苹果园更新前一年连续轮作葱、芥菜和小麦，导致其土壤中的根系分泌物十分复杂，进而影响了微生物在土壤中的有效定殖和功能发挥，目前还缺少适用于这种轮作改良方式的微生物菌剂。

技术实现思路

1、针对上述现有技术，本发明的目的是提供一株枯草芽孢杆菌tld4及其在减轻苹果连作障碍中的应用。

2、具体的，本发明涉及以下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供一株枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)tld4，该菌株已于2024年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为：cgmcc no.31990。

4、所述枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)tld4分离自连作苹果园幼树根际土壤，具有如下特性：

5、(1)对ard专化型层出镰孢菌(fusarium proliferatum f.sp.malus domestica)mr5以及尖孢镰孢菌、腐皮镰孢菌、瓜果腐霉菌等多种病原菌具有抑菌活性。

6、(2)对芥菜、小麦及葱、芥菜和小麦三者混合的根系分泌物具有较强的趋化性，有利于菌株在连续轮作葱、芥菜和小麦的苹果连作土壤中稳定定殖和发挥作用。

7、(3)菌株的发酵上清液中富含多种活性成分，对ard专化型层出镰孢菌(fusariumproliferatum f.sp.malus domestica)mr5以及尖孢镰孢菌、腐皮镰孢菌、瓜果腐霉菌等多种病原菌具有抑菌活性，不仅抑制了病原菌边缘菌丝的扩张，而且在一定程度上影响了其形态，促进了色素的积累。

8、(4)菌株的发酵上清液能显著提高连作土壤中种植的苹果幼树的枝条数和枝条长度。

9、上述枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)tld4的发酵液和/或发酵上清液也属于本发明的保护范围。

10、作为优选，所述枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)tld4的发酵液由如下方法制备而成：

11、将枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)tld4接种于lb液体培养基中，37℃、150rpm下振荡培养48h，制备得到发酵液。

12、作为优选，所述枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)tld4的发酵上清液由如下方法制备而成：

13、将枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)tld4接种于lb液体培养基中，37℃、150rpm下振荡培养48h，12000rpm，离心，过滤，分离上清，制备得到发酵上清液。

14、本发明的第二方面，提供上述枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)tld4或者枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)tld4的发酵液和/或发酵上清液在如下(1)或(2)中的应用：

15、(1)抑制植物病原菌的生长；

16、(2)制备植物病原菌的抑制剂。

17、优选的，所述植物病原菌为ard专化型层出镰孢菌(fusarium proliferatumf.sp.malus domestica)mr5、尖孢镰孢菌(fusarium oxysporum)、腐皮镰孢菌(fusariumsolani)、串珠镰孢菌(fusarium moniliforme)、瓜果腐霉(pythium aphanidermatum)、链格孢菌(alternaria alternata)和/或立枯丝核菌(rhizoctonia solani)。

18、本发明的第三方面，提供上述枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)tld4或者枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)tld4的发酵液和/或发酵上清液在如下(1)或(2)中的应用：

19、(1)减轻苹果连作障碍；

20、(2)制备减轻苹果连作障碍的生防制剂。

21、本发明的第四方面，提供上述枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)tld4在改良连作苹果园更新前一年连续轮作葱、芥菜和小麦后的苹果连作土壤中的应用。

22、上述应用中，所述枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)tld4通过对葱、芥菜和小麦的根系分泌物具有趋化性实现对苹果连作土壤的改良。

23、本发明的第五方面，提供上述枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)tld4的发酵上清液在如下(1)或(2)中的应用：

24、(1)提高连作土壤中种植的苹果幼树的枝条数和枝条长度；

25、(2)降低连作苹果根际土壤中ard专化型层出镰孢菌(fusarium proliferatumf.sp.malus domestica)mr5的基因拷贝数。

26、本发明的第六方面，提供一种减轻苹果连作障碍的方法，包括以下步骤：

27、在连作苹果园更新前一年连续轮作葱、芥菜和小麦；然后将枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)tld4的发酵液和或发酵上清液施于连续轮作葱、芥菜和小麦后的苹果连作土壤中。

28、本发明的有益效果：

29、本发明从连作苹果园幼树根际土壤中分离出一株枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)tld4，该枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)tld4对造成环渤海湾苹果连作障碍的主要病原菌ard专化型层出镰孢菌(fusarium proliferatum f.sp.malus domestica)mr5具有显著拮抗作用，同时对尖孢镰孢菌、腐皮镰孢菌、瓜果腐霉菌等病原菌也具有抑菌活性；而且，该枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)tld4对芥菜(brassica juncea)、小麦(triticum aestivum)以及葱、芥菜和小麦这3种植物的混合根分泌物有趋化性，能够在连续轮作葱、芥菜和小麦的苹果连作土壤中稳定定殖和发挥作用，进而提高了对连作苹果园更新前一年连续轮作葱、芥菜和小麦后的苹果连作土壤的改良效果，促进了嫁接苹果幼树生长，在一定程度上可减轻苹果树连作障碍造成的危害，为苹果连作障碍的生物防治提供了理论依据。