一种稳转萤火虫萤光素酶靶细胞株的构建方法及其应用

本发明涉及细胞免疫治疗，具体而言，涉及一种稳转萤火虫萤光素酶靶细胞株的构建方法及其应用。

背景技术：

1、近年来，随着免疫学理论的丰富及对众多肿瘤抗原的认识，免疫细胞治疗在肿瘤治疗临床应用中取得了突破性进展，截止目前，全球约有逾千种肿瘤免疫细胞治疗方案处于开发中。γδt、nk、nkt、m1型巨噬细胞等固有免疫细胞和cik、肿瘤浸润t淋巴细胞（til）、基因工程t细胞（car-t、tcr-t），肿瘤新抗原-细胞毒性t淋巴细胞治疗（neo-ctl）等获得性免疫细胞治疗技术已在多种肿瘤的治疗中取得了突破性进展。免疫细胞治疗技术已成为肿瘤治疗技术发展最受关注的方向。

2、在免疫细胞治疗技术的研发过程中，细胞杀伤实验作为免疫细胞治疗技术的研发过程中非常关键的验证手段，其技术稳定性、操作的简便性，结果的可靠性对于评估免疫细胞的制备质量，回输体内杀伤效率起到决定性意义。传统经典的免疫细胞杀伤效率检测中，如51铬（cr）释放法、乳酸脱氢酶(ldh)释放法，存在着设备要求高，检测背景高、信噪比大、操作繁琐、数据不稳定等诸多不利因素，严重制约着免疫细胞治疗技术的研发和临床应用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种稳转萤火虫萤光素酶靶细胞株的构建方法，其操作简单，高效快捷，可以构建得到共表达萤火虫萤光素酶、gfp和抗性筛选标记三个基因，且阳性率接近100%的稳转靶细胞株。

2、本发明的另一目的在于提供一种稳转萤火虫萤光素酶靶细胞株的应用，其能够用于免疫细胞杀伤活性测定，具有背景低，数据稳定，体系小，操作简单，设备要求低的特点。

3、本发明的实施例是这样实现的：

4、一种稳转萤火虫萤光素酶靶细胞株的构建方法，其包括：

5、以pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro为骨架质粒，以pselect-zeo-lucsh为目的质粒，将目的质粒中的lucsh (cpg-free)基因序列通过分子克隆和同源重组的方式构建到骨架质粒的mcs区，得到靶基因质粒，即pcdh-cmv-lucsh(cpg-free)-ef1-copgfp-t2a-puro；

6、将靶基因质粒进行慢病毒包装，得到病毒液；

7、利用病毒液感染肿瘤来源靶细胞，筛选获得稳转萤火虫荧光素酶靶细胞株。

8、一种稳转萤火虫萤光素酶靶细胞株在免疫细胞杀伤活力测定中的应用，该稳转萤火虫萤光素酶靶细胞株由上述构建方法得到。

9、本发明实施例的有益效果是：

10、本发明提供一种稳转萤火虫萤光素酶靶细胞株的构建方法及其应用，其以pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro为骨架质粒，通过分子克隆和同源重组的方式将mcs区重组为lucsh (cpg-free)基因序列，得到靶基因质粒pcdh-cmv-lucsh(cpg-free)-ef1-copgfp-t2a-puro，再通过慢病毒包装和转染，即可得到共表达萤火虫萤光素酶、gfp和抗性筛选标记的稳转萤火虫萤光素酶靶细胞株，该稳转萤火虫萤光素酶靶细胞株可以应用于免疫细胞杀伤靶细胞效率测定，具有背景低，数据稳定，体系小，操作简单，设备要求低的特点。

1.一种稳转萤火虫萤光素酶靶细胞株的构建方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括：

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述线性化引物包括42#-line-f和42#-line-r，其核苷酸序列分别如seq id no:1和seq id no:2所示。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述基因扩增引物包括lucsh(cpg-free)-f和lucsh(cpg-free)-r，其核苷酸序列分别如seq id no:3和seq id no:4所示。

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述靶基因质粒通过测序引物进行测序验证，所述测序引物为cmv-f，其核苷酸序列如seq id no:5所示。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，将所述靶细胞质粒与包装质粒一起转染293t细胞来进行慢病毒包装，所述包装质粒包括pspax2和pmd2g；所述靶细胞质粒和pspax2、pmd2g的质量比为4:3:1。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述肿瘤来源靶细胞包括k562、raji以及nalm6中的任一种。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，感染后的所述肿瘤来源靶细胞通过gfp筛选和嘌呤霉素筛选阳性细胞，得到所述稳转萤火虫荧光素酶靶细胞株。

9.一种稳转萤火虫萤光素酶靶细胞株在免疫细胞杀伤活力测定中的应用，其特征在于，所述稳转萤火虫萤光素酶靶细胞株由权利要求1~8任一项所述的构建方法得到。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述免疫细胞包括car-t细胞和nk细胞中的任一种。