一种近江牡蛎盐度调控SNP标记、引物组、试剂盒、鉴定方法及其应用

本发明属于基因工程与遗传育种领域，涉及一种近江牡蛎盐度调控snp标记、引物组、试剂盒、鉴定方法及其应用。

背景技术：

1、盐度是影响水生生物生命活动的重要基础环境因子之一，环境盐度的微弱波动会影响生物的生存能力。牛磺酸作为一种游离氨基酸，占牡蛎总游离氨基酸的47%-80%，具有重要的渗透调节作用。通过系统演化分析发现，牡蛎中牛磺酸合成通路的关键基因-cdo1基因出现了显著扩张，且在近江牡蛎中的扩张尤为显著。目前，缺乏对盐度适应基因cdo1调控位点的筛选。

技术实现思路

1、本发明的目的在于一种近江牡蛎盐度调控snp标记及其在鉴定耐盐牡蛎个体中的应用。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

3、一种近江牡蛎盐度调控snp标记，近江牡蛎盐度适应基因cdo1表达调控snp标记位于5号染色体第13289957位碱基。

4、所述snp标记为seq id no:2所示序列；该序列中第969位碱基，突变类型为a/g(顺式[cis]调控位点lg05:13289957)。

5、基因型为纯合或杂合，即基因型为tt或ct。

6、一种所述近江牡蛎盐度调控snp标记的应用，所述snp标记在鉴别盐度耐受牡蛎个体中的应用。

7、一种用于检测所述的snp标记的引物组，所述引物组为特异外围扩增引物和单碱基延伸引物基因序列；

8、特异外围扩增引物为：

9、lg05：13289957-f：5’-gacaaacaaagcaccgat-3’；

10、lg05：13289957-r：5’-aagacaggccgaggg-3’；

11、单碱基延伸引物基因序列为：

12、5’-tttttttttttttttttttttttttttttatcagataactttcattaaataggt

13、atca-3’。

14、一种所述的引物组应用，所述引物组在鉴别盐度耐受牡蛎个体中的应用。

15、一种用于检测所述的snp标记的试剂盒，包含所述的引物组。

16、一种鉴定盐度耐受牡蛎个体的方法，提取待检测牡蛎的基因组dna；以提取的基因组dna为模板，利用所述的引物组或所述试剂盒中特异外围扩增引物扩增包含目标snp位点的序列片段，而后利用引物对中单碱基延伸引物对snp位点进行分型检测，进而鉴定待检测牡蛎的基因型，根据基因型确定盐度耐受牡蛎的优势个体；其中，基因型为ct的个体为盐度耐受牡蛎个体。

17、所述确定待检测牡蛎的snp位点并进行分型检测：

18、a.提取的dna样品稀释后作为pcr模板，利用特异引物， 进行外围扩增；

19、pcr反应体系：dna聚合酶22μl、正向引物1μl、反向引物1μl、模板dna 1μl；pcr扩增的反应程序如表1所示：

20、表1 pcr扩增的反应程序

21、

22、b.snapshot pcr: 以pcr产物作为snapshot pcr的模板，产物纯化后，利用单碱基延伸引物进行位点的检测；

23、反应体系：dna聚合酶2μl、引物2μl、纯化后pcr 产物1μl；反应程序如表2所示：

24、表2 反应程序

25、

26、c.利用上述扩增产物鉴定每个个体的基因型。

27、本发明的有益效果：

28、本发明通过检测个体基因型的方法预测牡蛎个体盐度适应基因的表达高低，可快速大批量筛选不同表达水平牡蛎个体，鉴定耐盐牡蛎，且可通过无损取样技术在繁育前检测亲本基因型并应用于育种中，选择目标基因型组合个体作为亲本，进行分子标记辅助选择育种，繁育耐盐性高的子代，也能作为预测当今全球变暖的环境背景下牡蛎适应潜力的潜在标记；

29、本发明通过对牡蛎盐度适应关键基因cdo1进行基因表达全基因组关联分析（egwas），关联到一个关键的盐度适应基因cdo1的trans调控位点：lg05:13289957，位于smad4基因间区，可能通过影响smad4基因的功能、结构和表达进一步调控cdo1基因的表达水平；并获得其最佳基因型，将其基因型用于盐度适应基因不同表达水平的个体的预测。本发明的候选标记经液相芯片基因分型获得，由egwas分析得到，进一步针对该调控位点经其他群体验证，结果可靠，可用于cdo1基因不同表达水平个体的筛选，鉴定耐盐性高的牡蛎亲本，繁育耐盐性高的牡蛎个体，也可以预测牡蛎环境适应的潜力；

30、采用本发明方法也可以快速大批量筛选不同表达水平的牡蛎个体，且可以在繁育前对亲贝进行基因型鉴定，筛选耐盐性高的牡蛎亲本，提高子代盐度耐受能力，还能预测当今气候变化下牡蛎的适应潜力。本发明的结果可靠，获得的snp位点可信度高，效果稳定。

1.一种近江牡蛎盐度调控snp标记，其特征在于：近江牡蛎盐度调控snp标记位于5号染色体第13289957位碱基。

2.按权利要求1所述的近江牡蛎盐度调控snp标记，其特征在于：所述snp标记为seq idno:2所示序列；该序列中第969位碱基，突变类型为a/g(顺式[cis]调控位点lg05:13289957)。

3.按权利要求1或2所述的近江牡蛎盐度调控snp标记，其特征在于：基因型为纯合或杂合，即基因型为tt或ct。

4.一种权利要求1所述近江牡蛎盐度调控snp标记的应用，其特征在于：所述snp标记在鉴别盐度耐受牡蛎个体中的应用。

5.一种用于检测权利要求1所述的snp标记的引物组，其特征在于，引物组为特异外围扩增引物和单碱基延伸引物基因序列；

6.一种权利要求5所述的引物组的应用，其特征在于：所述引物组在鉴别盐度耐受牡蛎个体中的应用。

7.一种用于检测权利要求1所述的snp标记的试剂盒，其特征在于，包含权利要求5所述的引物组。

8.一种鉴定盐度耐受牡蛎个体的方法，其特征在于：提取待检测牡蛎的基因组dna；以提取的基因组dna为模板，利用权利要求5所述的引物组或权利要求7所述的试剂盒中特异外围扩增引物扩增包含目标snp位点的序列片段，而后利用引物对中单碱基延伸引物对snp位点进行分型检测，进而鉴定待检测牡蛎的基因型，根据基因型确定盐度耐受牡蛎的优势个体；其中，基因型为ct的个体为盐度耐受牡蛎个体。

9.按权利要求8所述的鉴定盐度耐受牡蛎个体的方法，其特征在于：