流感病毒和猴痘病毒超敏快速一体化检测试剂盒的制作方法

本发明涉及生物检测，具体涉及流感病毒和猴痘病毒超敏快速一体化检测试剂盒。

背景技术：

1、流感病毒是一种常见的急性呼吸道疾病，呈季节性流行或局部暴发特征。其中甲型流感病毒常引起世界范围内的流感大流行。而近期报道的猴痘病毒，也具有较高传染性和死亡率。而对于出入境口岸等重点地区的防疫要求或局部疫情暴发，所需要求较高，故需要对待测样本进行及时，快速和超敏的检测。

2、核酸检测是目前流感病毒和猴痘病毒检测的主要检测方法，但常规real-timert-pcr(rrt-pcr)技术耗时长，灵敏度低，对于要求较高的特定场景下存在局限性。

3、因此，本领域亟需一种快速、超敏的流感病毒和猴痘病毒的检测试剂盒。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种快速、超敏的流感病毒和猴痘病毒的检测试剂盒。

2、本发明的第一方面，一种用于同时检测流感病毒和猴痘病毒的引物探针集，所述引物集包括：

3、(a)针对甲型流感病毒的引物探针组，包括：

4、具有如seq id no：1所示核苷酸序列的上游引物、具有如seq id no：2所示核苷酸序列的下游引物和具有如seq id no：3所示核苷酸序列的探针；

5、(b)针对乙型流感病毒的引物探针组，包括：

6、具有如seq id no：4所示核苷酸序列的上游引物、具有如seq id no：5所示核苷酸序列的下游引物和具有如seq id no：6所示核苷酸序列的探针；和

7、(c)针对猴痘病毒的引物探针组，包括：

8、具有如seq id no：7所示核苷酸序列的上游引物、具有如seq id no：8所示核苷酸序列的下游引物和具有如seq id no：9所示核苷酸序列的探针。

9、在另一优选例中，所述针对甲型流感病毒的引物探针组选自下组：

10、(a1)具有如seq id no：1所示核苷酸序列的上游引物、具有如seq id no：2所示核苷酸序列的下游引物和具有如seq id no：3所示核苷酸序列的探针；

11、(a2)具有如seq id no：13所示核苷酸序列的上游引物、具有如seq id no：14所示核苷酸序列的下游引物和具有如seq id no：15所示核苷酸序列的探针；

12、(a3)具有如seq id no：16所示核苷酸序列的上游引物、具有如seq id no：17所示核苷酸序列的下游引物和具有如seq id no：18所示核苷酸序列的探针。

13、在另一优选例中，所述的探针具有磷酸化的核苷酸。

14、在另一优选例中，所述的探针有荧光基团和淬灭基团。

15、在另一优选例中，所述的上游引物和下游引物中的一个或多个核苷酸被锁核酸取代。

16、在另一优选例中，所述荧光基团选自下组：fam、cy3、cy5、vic、hex、joe、tamra、rox、tet、ned、或其组合。

17、在另一优选例中，所述淬灭基团选自下组：mgb、bhq1、bhq2、bhq3、tamra、或其组合。

18、在另一优选例中，所述磷酸化的核苷酸位于探针3’端第1到第3位上。

19、在另一优选例中，所述荧光基团修饰在探针5’端的第1到第5位的核苷酸上，较佳地第2到第5位，更佳地第3到第5位。

20、在另一优选例中，所述淬灭基团修饰在探针3’端的第1到第5位的核苷酸上，较佳地第2到第5位，更佳地第3到第5位。

21、在另一优选例中，所述探针仅有一个磷酸化的核苷酸。

22、在另一优选例中，所述的上游引物和下游引物中的一个核苷酸被锁核酸取代。

23、在另一优选例中，所述锁核酸取代鸟嘌呤对应的核苷酸。

24、在另一优选例中，所述锁核酸取代胞嘧啶对应的核苷酸。

25、在另一优选例中，所述引物探针集还包括针对内参的引物和探针，优选，具有如seq id no：10所示核苷酸序列的上游引物、具有如seq id no：11所示核苷酸序列的下游引物和具有如seq id no：12所示核苷酸序列的探针。

26、在另一优选例中，所述引物探针集包括

27、

28、

29、本发明第二方面，提供了如本发明第一方面所述的引物探针集的用途，用于制备检测病毒的检测试剂或试剂盒。

30、在另一优选例中，所述病毒选自下组：甲型流感病毒、乙型流感病毒、或其组合。

31、本发明第三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括(i)容器和(ii)如本发明第一方面所述的引物探针集。

32、在另一优选例中，所述试剂盒还包括聚合酶，所述聚合酶选自下组：taq酶、vent酶、tth酶、或其组合。

33、在另一优选例中，所述聚合酶以冻干微球的形式存在。

34、在另一优选例中，所述的聚合酶中taq酶、vent酶和tth酶的酶活比为：1～10：0.1～5:1～5，较佳地1～5：0.2～3：1～3，更佳地1～3：0.5～1：1～2。

35、在另一优选例中，所述试剂盒还包括蛋白酶k。

36、在另一优选例中，所述试剂盒还包括采样干拭子套装，所述干拭子套装包括拭子头与拭子主干，所述拭子头与拭子主干只有两个结合点。

37、在另一优选例中，所述试剂盒还包括核酸扩增反应所需的试剂，优选所述核酸扩增反应为常规pcr或者实时荧光pcr或者数字pcr。

38、在另一优选例中，所述核酸扩增反应所需的试剂包括mg2+、三磷酸脱氧核糖核苷酸。

39、本发明第四方面，提供了一种同时检测流感病毒和猴痘病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

40、(s1)提供待测样本、如本发明第一方面所述的引物探针集和聚合酶；

41、(s2)在适合扩增的条件下，使用所述的引物探针集对待测样本进行核酸扩增，进行检测，从而得到检测结果。

42、在另一优选例中，所述待测样本经蛋白酶k处理。

43、在另一优选例中，所述流感病毒选自下组：甲型流感病毒、乙型流感病毒、或其组合。

44、在另一优选例中，在聚合酶的作用下使用所述的引物探针集对待测样本进行核酸扩增，进行检测，从而得到检测结果。

45、在另一优选例中，所述聚合酶选自下组：taq酶、vent酶、tth酶、或其组合。

46、在另一优选例中，所述聚合酶以冻干微球的形式存在。

47、在另一优选例中，所述的聚合酶中taq酶、vent酶和tth酶的酶活比为：1～10：0.1～5:1～5，较佳地1～5：0.2～3：1～3，更佳地1～3：0.5～1：1～2。

48、在另一优选例中，所述检测包括检测荧光信号。

49、在另一优选例中，所述核酸扩增选自下组：pcr、qpcr、数字pcr、核酸等温扩增、rt-pcr、或其组合。

50、在另一优选例中，所述扩增的反应条件为：50℃，5分钟，1个循环；97℃，1分钟，1个循环；97℃，5秒，60℃，10秒，40个循环。

51、在另一优选例中，所述方法的灵敏度≤100拷贝/ml，较佳地≤75拷贝/ml，更佳地≤50拷贝/ml。

52、在另一优选例中，所述方法的特异性≥95％，较佳地≥96％，更佳地≥98％。

53、在另一优选例中，所述方法的灵敏度≥80％，较佳地≥90％，更佳地≥95％。

54、在另一优选例中，所述方法是非治疗非诊断的。

55、在另一优选例中，所述方法是体外的。

56、本发明第五方面，提供了一种用于检测甲流病毒的引物探针集，包括：

57、(a1)具有如seq id no：1所示核苷酸序列的上游引物、具有如seq id no：2所示核苷酸序列的下游引物和具有如seq id no：3所示核苷酸序列的探针；

58、(a2)具有如seq id no：13所示核苷酸序列的上游引物、具有如seq id no：14所示核苷酸序列的下游引物和具有如seq id no：15所示核苷酸序列的探针；

59、(a3)具有如seq id no：16所示核苷酸序列的上游引物、具有如seq id no：17所示核苷酸序列的下游引物和具有如seq id no：18所示核苷酸序列的探针。

60、在另一优选例中，所述引物探针集还包括针对内参的引物和探针，优选，具有如seq id no：10所示核苷酸序列的上游引物、具有如seq id no：11所示核苷酸序列的下游引物和具有如seq id no：12所示核苷酸序列的探针。

61、在另一优选例中，所述的探针具有磷酸化的核苷酸。

62、在另一优选例中，所述的探针有荧光基团和淬灭基团。

63、在另一优选例中，所述的上游引物和下游引物中的一个或多个核苷酸被锁核酸取代。

64、在另一优选例中，所述荧光基团选自下组：fam、cy3、cy5、vic、hex、joe、tamra、rox、tet、ned、或其组合。

65、在另一优选例中，所述淬灭基团选自下组：mgb、bhq1、bhq2、bhq3、tamra、或其组合。

66、在另一优选例中，所述磷酸化的核苷酸位于探针3’端第1到第3位上。

67、在另一优选例中，所述荧光基团修饰在探针5’端的第1到第5位的核苷酸上，较佳地第2到第5位，更佳地第3到第5位。

68、在另一优选例中，所述淬灭基团修饰在探针3’端的第1到第5位的核苷酸上，较佳地第2到第5位，更佳地第3到第5位。

69、在另一优选例中，所述探针仅有一个磷酸化的核苷酸。

70、在另一优选例中，所述的上游引物和下游引物中的一个核苷酸被锁核酸取代。

71、在另一优选例中，所述锁核酸取代鸟嘌呤对应的核苷酸。

72、在另一优选例中，所述锁核酸取代胞嘧啶对应的核苷酸。

73、在另一优选例中，所述引物探针集包括：

74、

75、在另一优选例中，所述引物探针集用于制备检测甲流病毒的检测试剂或试剂盒。

76、本发明第六方面，提供了一种检测乙流病毒的引物探针集，包括：

77、具有如seq id no：4所示核苷酸序列的上游引物、具有如seq id no：5所示核苷酸序列的下游引物和具有如seq id no：6所示核苷酸序列的探针。

78、在另一优选例中，所述引物探针集还包括针对内参的引物和探针，优选，具有如seq id no：10所示核苷酸序列的上游引物、具有如seq id no：11所示核苷酸序列的下游引物和具有如seq id no：12所示核苷酸序列的探针。

79、在另一优选例中，所述的探针具有磷酸化的核苷酸。

80、在另一优选例中，所述的探针有荧光基团和淬灭基团。

81、在另一优选例中，所述的上游引物和下游引物中的一个或多个核苷酸被锁核酸取代。

82、在另一优选例中，所述荧光基团选自下组：fam、cy3、cy5、vic、hex、joe、tamra、rox、tet、ned、或其组合。

83、在另一优选例中，所述淬灭基团选自下组：mgb、bhq1、bhq2、bhq3、tamra、或其组合。

84、在另一优选例中，所述磷酸化的核苷酸位于探针3’端第1到第3位上。

85、在另一优选例中，所述荧光基团修饰在探针5’端的第1到第5位的核苷酸上，较佳地第2到第5位，更佳地第3到第5位。

86、在另一优选例中，所述淬灭基团修饰在探针3’端的第1到第5位的核苷酸上，较佳地第2到第5位，更佳地第3到第5位。

87、在另一优选例中，所述探针仅有一个磷酸化的核苷酸。

88、在另一优选例中，所述的上游引物和下游引物中的一个核苷酸被锁核酸取代。

89、在另一优选例中，所述锁核酸取代鸟嘌呤对应的核苷酸。

90、在另一优选例中，所述锁核酸取代胞嘧啶对应的核苷酸。

91、在另一优选例中，所述引物探针集包括：

92、

93、在另一优选例中，所述引物探针集用于制备检测乙流病毒的检测试剂或试剂盒。

94、本发明第七方面提供了，一种用于检测猴痘病毒的引物探针集，包括

95、具有如seq id no：7所示核苷酸序列的上游引物、具有如seq id no：8所示核苷酸序列的下游引物和具有如seq id no：9所示核苷酸序列的探针。

96、在另一优选例中，所述引物探针集还包括针对内参的引物和探针，优选，具有如seq id no：10所示核苷酸序列的上游引物、具有如seq id no：11所示核苷酸序列的下游引物和具有如seq id no：12所示核苷酸序列的探针。

97、在另一优选例中，所述的探针具有磷酸化的核苷酸。

98、在另一优选例中，所述的探针有荧光基团和淬灭基团。

99、在另一优选例中，所述的上游引物和下游引物中的一个或多个核苷酸被锁核酸取代。

100、在另一优选例中，所述荧光基团选自下组：fam、cy3、cy5、vic、hex、joe、tamra、rox、tet、ned、或其组合。

101、在另一优选例中，所述淬灭基团选自下组：mgb、bhq1、bhq2、bhq3、tamra、或其组合。

102、在另一优选例中，所述磷酸化的核苷酸位于探针3’端第1到第3位上。

103、在另一优选例中，所述荧光基团修饰在探针5’端的第1到第5位的核苷酸上，较佳地第2到第5位，更佳地第3到第5位。

104、在另一优选例中，所述淬灭基团修饰在探针3’端的第1到第5位的核苷酸上，较佳地第2到第5位，更佳地第3到第5位。

105、在另一优选例中，所述探针仅有一个磷酸化的核苷酸。

106、在另一优选例中，所述的上游引物和下游引物中的一个核苷酸被锁核酸取代。

107、在另一优选例中，所述锁核酸取代鸟嘌呤对应的核苷酸。

108、在另一优选例中，所述锁核酸取代胞嘧啶对应的核苷酸。

109、在另一优选例中，所述引物探针集包括：

110、

111、在另一优选例中，所述引物探针集用于制备检测猴痘病毒的检测试剂或试剂盒。

112、本发明第八方面，提供了一种检测病毒的方法，包括步骤：

113、(s1)提供待测样本、如本发明第五方面或本发明第六方面或本发明第七方面所述的引物探针集和聚合酶；

114、(s2)在适合扩增的条件下，使用所述的引物探针集对待测样本进行核酸扩增，进行检测，从而得到检测结果。

115、在另一优选例中，所述病毒选自下组：甲流病毒、乙流病毒、或猴痘病毒。

116、在另一优选例中，所述待测样本经蛋白酶k处理。

117、在另一优选例中，在聚合酶的作用下使用所述的引物探针集对待测样本进行核酸扩增，进行检测，从而得到检测结果。

118、在另一优选例中，所述聚合酶选自下组：taq酶、vent酶、tth酶、或其组合。

119、在另一优选例中，所述聚合酶以冻干微球的形式存在。

120、在另一优选例中，所述的聚合酶中taq酶、vent酶和tth酶的酶活比为：1～10：0.1～5:1～5，较佳地1～5：0.2～3：1～3，更佳地1～3：0.5～1：1～2。

121、在另一优选例中，所述检测包括检测荧光信号。

122、在另一优选例中，所述核酸扩增选自下组：pcr、qpcr、数字pcr、核酸等温扩增、rt-pcr、或其组合。

123、在另一优选例中，所述扩增的反应条件为：50℃，5分钟，1个循环；97℃，1分钟，1个循环；97℃，5秒，60℃，10秒，40个循环。

124、在另一优选例中，所述方法的灵敏度≤100拷贝/ml，较佳地≤75拷贝/ml，更佳地≤50拷贝/ml。

125、在另一优选例中，所述方法的特异性≥95％，较佳地≥96％，更佳地≥98％。

126、在另一优选例中，所述方法的灵敏度≥80％，较佳地≥90％，更佳地≥95％。

127、在另一优选例中，所述方法是非治疗非诊断的。

128、在另一优选例中，所述方法是体外的。

129、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。