基于RPA-CRISPR/Cas12a检测常见呼吸道病毒的crRNA及多重检测试剂盒与应用

1.基于rpa-crispr/cas12a检测呼吸道病毒的crrna，其特征在于：所述呼吸道病毒包括新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒或/和副流感病毒；检测新型冠状病毒的crrna序列如seq id no:1或seq id no:4所示；检测甲型流感病毒的crrna序列如seq id no:7所示；检测乙型流感病毒的crrna序列如seq id no:10所示；检测呼吸道合胞病毒的crrna序列如seq id no:13所示；检测副流感病毒的crrna序列如seq id no:16所示。

2.权利要求1所述的crrna扩增呼吸道病毒的rpa扩增引物，其特征在于：扩增新型冠状病毒的rpa扩增引物的序列如seq id no:2-3或seq id no:5-6所示；扩增甲型流感病毒的rpa扩增引物的序列如seq id no:8-9所示；扩增乙型流感病毒的rpa扩增引物的序列如seqid no:11-12所示；扩增呼吸道合胞病毒的rpa扩增引物的序列如seq id no:14-15所示；扩增副流感病毒的rpa扩增引物的序列如seq id no:17-18所示。

3.一种基于rpa-crispr/cas12a检测呼吸道病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求2所述rpa扩增引物和crispr/cas12a检测体系；所述crispr/cas12a检测体系包括权利要求1所述的crrna序列、crispr/cas12a蛋白和ssdna报告荧光探针。

4.根据权利要求3所述的基于rpa-crispr/cas12a检测呼吸道病毒的试剂盒，其特征在于：所述ssdna报告荧光探针为利用6-羧基荧光和荧光淬灭剂标记ssdna。

5.一种非疾病诊断目的采用权利要求3-4任一项所述的试剂盒检测呼吸道病毒的方法，其特征在于：包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的试剂盒检测呼吸道病毒的方法，其特征在于：所述试剂盒利用采用离心式微流控芯片或ep管进行检测。

7.根据权利要求5所述的试剂盒检测呼吸道病毒的方法，其特征在于：所述试剂盒采用离心式微流控芯片时，将rpa扩增引物、crrna序列以冻干粉形式预埋至芯片反应腔，将crispr/cas12a检测体系预埋至芯片独立检测腔，将步骤(1)中提取的核酸加入储液池，通过离心，将步骤(1)中提取的核酸分流至芯片反应腔进行rpa扩增反应，扩增结束后，离心，扩增产物进入芯片独立检测腔，最后检测独立检测腔的荧光信号，当独立检测腔发出荧光，则表示待测样品中含有呼吸道病毒，当独立检测腔系未发出荧光，则表示待测样品未感染呼吸道病毒。

8.根据权利要求5所述的试剂盒检测呼吸道病毒的方法，其特征在于：所述试剂盒采用ep管时，将crispr/cas12a检测体系滴入ep管盖内壁，将rpa扩增引物添加至ep管底部，并往ep管底部加入待测样本，待扩增反应结束后，通过离心将crispr/cas12a检测体系与rpa扩增产物混合进行检测反应，最后检测反应体系的荧光信号，当反应体系发出荧光，则表示待测样品中含有呼吸道病毒当反应体系未发出荧光，则表示待测样品未感染呼吸道病毒。

9.根据权利要求5所述的试剂盒检测呼吸道病毒的方法，其特征在于：所述步骤(2)中rpa扩增引物的浓度为10μm，上下游引物浓度比为1:1。

10.根据权利要求5所述的试剂盒检测呼吸道病毒的方法，其特征在于：所述步骤(3)crispr/cas12a检测体系中crrna序列的浓度为2μm，ssdna报告荧光探针浓度为10μm，cas12a浓度为1μm。