一种NK细胞培养基及体外扩增NK细胞的方法与流程

本发明涉及细胞培养，尤其涉及一种nk细胞培养基及体外扩增nk细胞的方法。

背景技术：

1、自然杀伤细胞又名nk细胞，nk细胞治疗是一种非特性细胞治疗，临床研究表明nk抗肿瘤具有一定疗效，是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生；从外周血中分离出单个核细胞，经过体外激活、扩增后回输到患者体内，增强患者免疫功能或直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞，可以有效抑制肿瘤细胞转移和扩散。

2、在储运或分批次使用nk细胞时，不可避免了对细胞的损伤，使nk细胞的增殖能力和杀伤能力偏低。

3、因此，提供一种提高nk细胞的增殖能力和杀伤能力的nk细胞培养基及体外扩增nk细胞的方法具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，一方面，本发明提供了一种nk细胞培养基，所述nk细胞培养基由质量份数为16~25%的中药提取物和补足余量的无血清培养液组成；

2、所述中药提取物的制备方法如下：取质量份数为14~20%的桑黄、质量份数为12~18%的紫锥菊、质量份数为10~15%的黄芪、质量份数为7~12%的灵芝、质量份数为5~9%的何首乌和补齐其余质量份数的纯水，切碎上述药材过50目筛，加入质量为上述药材和水总质量6倍的85 %乙醇62℃浸没12h，固液一起倒入闪式提取器，转速5000r/min提取1min，出料后200目过滤得粗滤提取液；将所述粗滤提取液补加0.2倍质量的纯水后于60℃且压强200mbar的旋转蒸发仪中减压蒸馏至无液体连续流出，收集剩余液得中药提取物。

3、进一步地，所述中药提取物的质量份数为20%。

4、进一步地，所述桑黄的质量份数为17%。

5、进一步地，所述紫锥菊的质量份数为16%。

6、进一步地，所述黄芪的质量份数为13%。

7、进一步地，所述灵芝的质量份数为10%。

8、进一步地，所述何首乌的质量份数为7%。

9、另一方面，本发明提供了一种使用如上述的nk细胞培养基的体外扩增nk细胞的方法，所述体外扩增nk细胞的方法为：

10、向培养瓶中加入nk细胞，取样计数并用所述nk细胞培养基稀释细胞密度至1×106/ml，放入37℃且5％co2的培养箱培养15d后取样计数，培养期间循环使用433mhz微波照射280s和2450mhz微波照射70s，上述两种微波照射互相间隔6h。

11、通过本发明能够带来如下有益效果：

12、本发明具有独特的培养-照射体系，能够使nk细胞达成独特的促增殖-强杀伤效果。

13、本发明使用桑黄、紫锥菊、黄芪、灵芝和何首乌这五种药材通过本发明特有的配比和提取工艺制得的中药提取物，一方面能够改善nk细胞环境、提高nk细胞活力，促进nk细胞增殖和对肿瘤细胞杀伤的同时提高nk细胞抗微波热效应的“抗逆性”来配合本发明后面的微波照射，另一方面本发明的微波照射也进一步促进了本发明中药提取物的药效；

14、本发明的两种微波交替照射能够促进nk细胞产生多种细胞因子，配合本发明的中药提取物再来促进nk细胞的增殖力和杀伤力。

1.一种nk细胞培养基，其特征在于，所述nk细胞培养基由质量份数为16~25%的中药提取物和补足余量的无血清培养液组成；

2.根据权利要求1所述的nk细胞培养基，其特征在于，所述中药提取物的质量份数为20%。

3.根据权利要求1所述的nk细胞培养基，其特征在于，所述桑黄的质量份数为17%。

4.根据权利要求1所述的nk细胞培养基，其特征在于，所述紫锥菊的质量份数为16%。

5.根据权利要求1所述的nk细胞培养基，其特征在于，所述黄芪的质量份数为13%。

6.根据权利要求1所述的nk细胞培养基，其特征在于，所述灵芝的质量份数为10%。

7.根据权利要求1所述的nk细胞培养基，其特征在于，所述何首乌的质量份数为7%。

8.一种使用如权利要求1~7任一所述的nk细胞培养基的体外扩增nk细胞的方法，其特征在于，所述体外扩增nk细胞的方法为：