一种提高嗜热毁丝霉的纤维素降解能力的方法及工程菌株

本发明涉及农业生物，具体涉及一种提高嗜热毁丝霉的纤维素降解能力的方法及工程菌株。

背景技术：

1、纤维素作为木质纤维素类生物质的主要成分，由葡萄糖结构单元通过β-1,4-糖苷键连接而成。而在纤维素的三维结构中，纤维素分子链彼此平行排列，通过氢键和范德华力相互作用形成了高度结晶的结构。这些结晶结构的存在显著增强了纤维素的稳定性和抗降解性，使其难以被生物酶分解。

2、纤维素的生物降解传统上认为主要依赖于糖苷水解酶如纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶间的协同作用；近年来，氧化还原酶如裂解性多糖单加氧酶作为一类新型的多糖降解酶，被发现通过氧化方式断裂纤维素结晶区域的糖苷键，来参与纤维素的生物降解过程。但是目前尚未报道同时改造微生物氧化还原酶和糖苷水解酶可显著提升其降解纤维素的能力，关于联合氧化还原酶和糖苷水解酶降解纤维素的研究仅在体外利用纯化酶研究过，仅限于氧化还原酶裂解性多糖单加氧酶和糖苷水解酶纤维二糖水解酶/内切葡聚糖酶，并且有拮抗作用的报道，例如，在纤维二糖水解酶cel7a降解纤维素上，裂解性多糖单加氧酶lpmo9e降低了纤维寡糖产量14%，在内切葡聚糖酶cel5a降解纤维素上，裂解性多糖单加氧酶lpmo9j降低了纤维寡糖产量60%。

3、嗜热毁丝霉( myceliophthora thermophila)是一种工业中用于生产纤维素降解酶的高温丝状真菌底盘菌株，在木质纤维素降解和利用过程中具有较高的开发应用价值。虽然经过多年的研究，已获得多个嗜热毁丝霉高产纤维素降解酶的菌株，如碱性蛋白酶基因 alp1缺陷型菌株。但是目前纤维素降解酶的高成本依旧是制约木质纤维素类生物质转化利用的瓶颈问题。因而进一步提升其纤维素降解酶的效率是潜在解决该问题的对策。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有技术中纤维素转化效率低、成本高的缺陷，本发明的目的是提供一种提高嗜热毁丝霉的纤维素降解能力的方法。

2、本发明的再一目的是提供纤维素降解能力提高的嗜热毁丝霉工程菌株。

3、根据本发明的提高嗜热毁丝霉的纤维素降解能力的方法，所述方法包括在嗜热毁丝霉中过表达同源的编码裂解性多糖单加氧酶（lpmo）的基因和编码β-葡萄糖苷酶（bgl）的基因的步骤。

4、其中，所述裂解性多糖单加氧酶的氨基酸序列如seq id no：3所示，所述β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如seq id no：4所示。

5、根据本发明的提高嗜热毁丝霉的纤维素降解能力的方法，其中，所述编码裂解性多糖单加氧酶的基因的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述编码β-葡萄糖苷酶的基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。

6、根据本发明的提高嗜热毁丝霉的纤维素降解能力的方法，其中，为了提高蛋白酶的表达量，优选敲除蛋白酶基因，因此，所述嗜热毁丝霉为碱性蛋白酶基因缺陷型。

7、根据本发明的纤维素降解能力提高的嗜热毁丝霉工程菌株，所述嗜热毁丝霉工程菌株为过表达同源的编码裂解性多糖单加氧酶的基因和编码β-葡萄糖苷酶的基因的嗜热毁丝霉菌株。

8、其中，所述裂解性多糖单加氧酶的氨基酸序列如seq id no：3所示，所述β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如seq id no：4所示。

9、根据本发明的纤维素降解能力提高的嗜热毁丝霉工程菌株，所述嗜热毁丝霉工程菌株为碱性蛋白酶基因缺陷型。

10、lpmo基因 seq id no：1

11、atgaagtccttcaccctcaccactctggccgccctggctggcaacgccgccgctcacgcgaccttccaggccctctgggtcgacggcgtcgactacggcgcgcagtgtgcccgtctgcccgcgtccaactcgccggtcaccgacgtgacctccaacgcgatccgctgcaacgccaacccctcgcccgctcggggcaagtgcccggtcaaggccggctcgaccgttacggtcgagatgcatcagcaacccggtgaccgctcgtgcagcagcgaggcgatcggcggggcgcactacggccccgtgatggtgtacatgtccaaggtgtcggacgcggcgtcggcggacgggtcgtcgggctggttcaaggtgttcgaggacggctgggccaagaacccgtccggcgggtcgggcgacgacgactactggggcaccaaggacctgaactcgtgctgcgggaagatgaacgtcaagatccccgccgacctgccctcgggcgactacctgctccgggccgaggccctcgcgctgcacacggccggcagcgcgggcggcgcccagttctacatgacctgctaccagctcaccgtgaccggctccggcagcgccagcccgcccaccgtctccttcccgggcgcctacaaggccaccgacccgggcatcctcgtcaacatccacgccccgctgtccggctacaccgtgcccggcccggccgtctactcgggcggctccaccaagaaggccggcagcgcctgcaccggctgcgagtccacttgcgccgtcggctccggccccaccgccaccgtctcccagtcgcccggttccaccgccacctcggcccccggcggcggcggcggctgcaccgtccagaagtaccagcagtgcggcggccagggctacaccggctgcaccaactgcgcgtccggctccacctgcagcgcggtctcgccgccctactactcgcagtgcgtc。

12、bgl基因，seq id no：2

13、atgacccttcaagcctttgcgctgctggcggcggcggcccttgtacggggcgagaccccgaccaaggtccctcgcgacgctccgagaggagctgctgcttgggaagctgcccactcctcagcagccgctgccttgggaaagctgtcccagcaggacaagatcaacatcgtgacgggcgtcggctggaacaaggggccctgcgtgggcaatactcccgctatcagctccatcaactacccgcagctctgcctccaagacggacccctgggcgtccgcttcggttccagcatcaccgctttcactccaggcattcaggccgcgtcgacgtgggatgtggacctgatccgacaacgaggcgagtacatgggcgccgagttcaaggggtgtggcatccacgtccagctaggccccgtggccgggcccttgggtaaggttccgcaaggcggccgcaactgggagggctttggcgtggatccctacctcaccggcattgccatggccgagaccatcgaggggatacagtcagcgggcgtgcaagccaccgccaagcattacatcctcaacgagcaggagctcaaccgcgagaccatgagcagcaatgtcgacgaccgcaccttgcacgagctgtacctctggccttttgcagacgctgttcactctaacgtggccagcgtcatgtgcagttacaacaagatcaacggcacgtgggcgtgcgagaacgaccgggtgctgaacgtcattctgaagcaggagcttgggtttccgggctatgtgatgagcgactggaacgcgcagcactcgaccgacgacgcggccaaccacggcatggacatgacgatgcccggcagcgacttcaacggagggacgattctctggggcccgcagctcgacagcgccgtcaacagcggccgggtgcccaagtcccgcctcgacgacatggtcgagcgcatcctcgcggcgtggtaccttctcggtcaggacagcaattacccggctatcaacatcggcgccaacgtacagggcaaccacaaggagaacgtgcgggcggtcgcgcgcgatggcatcgtgctcctcaagaacgacgacggcatcctcccgctcaagaagcccgccaagctcgccctcatcggttcggccgccgtcgtcaacccgcagggactgaactcctgccaggatcagggctgcaacaaaggcgcgctgggcatgggatgggggtccggggcggtcaactacccgtactttgtcgcgccgtacgacgcgctcaaggcccgcgcccaagaggacgggacgacggtcagcctgcacaactcggacagcacgagcggggtggcgaacgtggcctcggacgcggacgcggccatcgtggtcatcacggccgactcgggcgagggttacatcacagtcgaaggcgccgccggggaccggctgaacctcgacccgtggcacaacggcaacgagctggtaaaggcggtggcggcggccaacaagaacaccatcgtcgtcgtgcacagcgtcgggcccatcatcctcgagaccatcctggcaaccgaaggggtcaaggcgattgtgtgggccggcctgccaagccaggagaatggtaacgcgctggtggacatcctgtacggtctggcctcgccgtcgggcaagctggtctacaccatcgccaagcgagaacaggactacggcactgcggtcgttcgcggagacgacacatttccggagggcctgtttgtcgactaccggcactttgacaaggagaacatcgagccgcggtacgagtttgggtttgggctgtcatacaccaacttcacgtacgccgacctcgaactcacctcgaccgccacggccggcccagcgacgggcgagaccatccccggcggcgcggccgacctctgggaggaggtggccacggtcacggcgaccatcaccaacagcggcggcgtggacggcgccgaggtggcccagctgtacctgacgttgccgtcgtcggcgccggcgaccccgcccaagcagctccgcggcttcgccaagctcaagctggcggccggcgccagcgggaccgcgacgtttagtctgcgcaggcgcgacctcagctactgggacaccggccgcgggcagtgggtggtgccggagggcgagtttggcgtctcggtcggggcgagctcgcgcgatatccggctgacggggagcttccgagtatga。

14、lpmo的氨基酸序列如seq id no：3所示，所述bgl的氨基酸序列序列如seq id no：4所示。

15、lpmo的氨基酸序列，seq id no：3：

16、mksftlttlaalagnaaahatfqalwvdgvdygaqcarlpasnspvtdvtsnaircnanpspargkcpvkagstvtvemhqqpgdrscsseaiggahygpvmvymskvsdaasadgssgwfkvfedgwaknpsggsgdddywgtkdlnsccgkmnvkipadlpsgdyllraealalhtagsaggaqfymtcyqltvtgsgsaspptvsfpgaykatdpgilvnihaplsgytvpgpavysggstkkagsactgcestcavgsgptatvsqspgstatsapgggggctvqkyqqcggqgytgctncasgstcsavsppyysqcv。

17、bgl的氨基酸序列序列，seq id no：4：

18、mtlqafallaaaalvrgetptkvprdaprgaaaweaahssaaaalgklsqqdkinivtgvgwnkgpcvgntpaissinypqlclqdgplgvrfgssitaftpgiqaastwdvdlirqrgeymgaefkgcgihvqlgpvagplgkvpqggrnwegfgvdpyltgiamaetiegiqsagvqatakhyilneqelnretmssnvddrtlhelylwpfadavhsnvasvmcsynkingtwacendrvlnvilkqelgfpgyvmsdwnaqhstddaanhgmdmtmpgsdfnggtilwgpqldsavnsgrvpksrlddmverilaawyllgqdsnypainiganvqgnhkenvravardgivllknddgilplkkpaklaligsaavvnpqglnscqdqgcnkgalgmgwgsgavnypyfvapydalkaraqedgttvslhnsdstsgvanvasdadaaivvitadsgegyitvegaagdrlnldpwhngnelvkavaaankntivvvhsvgpiiletilategvkaivwaglpsqengnalvdilyglaspsgklvytiakreqdygtavvrgddtfpeglfvdyrhfdkeniepryefgfglsytnftyadleltstatagpatgetipggaadlweevatvtatitnsggvdgaevaqlyltlpssapatppkqlrgfaklklaagasgtatfslrrrdlsywdtgrgqwvvpegefgvsvgassrdirltgsfrv*。

19、本发明一些实施方案中，将所述嗜热毁丝霉工程菌株在40~50 ℃下培养2~4天，优选在45 ℃下培养3天。发酵培养基包括碳源、氮源、无机盐、微量金属元素。所述碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、玉米芯、玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆中的一种或多种。所述氮源包括但不限于酵母膏、蛋白胨、柠檬酸三钠、铵盐和硝酸盐中的一种或多种。所述无机盐包括但不限于硫酸盐、盐酸盐、硝酸盐和磷酸盐中的一种或多种。所述微量金属元素源包括但不限于钾、钙、镁、铁、铜、锌和锰的硫酸盐、盐酸盐和硝酸盐中的一种或多种。

20、本发明一些实施方案中，所述100 ml发酵培养基含有：2 ml 50 × vogel’s溶液，2 g玉米芯，4 μm硫酸铜，98 ml水。

21、本发明的有益效果在于：

22、使用本发明所述嗜热毁丝霉基因工程菌δ alp1- mtlpmo-mtbgl降解微晶纤维素的能力显著高于出发菌，纤维寡糖总产量增加了68.53%，纤维寡糖酸总产量增加了189.08%，其中葡萄糖产量增加了254.14%。使用本发明所述嗜热毁丝霉基因工程菌δ alp1- mtlpmo- mtbgl降解碱处理玉米芯的能力显著高于出发菌，纤维寡糖总产量增加了57.11%，纤维寡糖酸总产量增加了129.91%，其中葡萄糖产量增加了212.75%。本发明在提升纤维素降解酶的效率中具有重要的借鉴指导意义，对降低木质纤维素类生物质转化成本具有重要价值。