结合促血管发生生长因子的多肽的制作方法

本发明涉及生物技术，和涉及人类健康的领域。本发明提供了结合促血管发生生长因子（例如，人血管内皮生长因子（vegf）或碱性成纤维细胞生长因子（bfgf））并且抑制其生物学效应的多肽。本发明提供了用于生成包含所述多肽的药学组合物的基础，所述药学组合物在治疗随增加的血管发生、炎症和免疫抑制而出现的病理学状况中使用。

背景技术：

0、现有技术

1、“从新”血管形成过程目前在多种疾病的研究中占据中心位置，并且血管发生现在被描述为在新型药物的发现中的一项组织原则（folkman, nat rev drug discov, 2007,6: 273-86）。在过去十年中，多种基于内皮增殖的抑制剂以及血管结构的装配和通透性的调制剂的治疗被批准用于在人中使用。这些治疗可以被划分为三个基本组：i) 采用小的和酪氨酸激酶抑制剂类型的多肽的治疗；ii) 基于抗体、其片段和变异形式的治疗；iii) 采用插入在病毒载体中的编码抗体、其片段或变异形式的脱氧核糖核酸（dna）序列的治疗（apte等人, cell, 2019, 176: 1248-64）。

2、在临床试验的高级阶段中包括完整的单克隆抗体和保留抗原结合位点的其片段。尽管有单克隆抗体的治疗成功，但是从生产角度来看它们具有一系列缺点。其高的分子量（150 000 da）、其异四聚体组成和将近15个二硫键的存在妨碍了其在细菌中的容易产生，并且给在真核细胞中的产生带来困难。此外，其高的分子大小阻碍渗透入组织中，这限制了其定位于作用位点（jovčevska和muyldermans, biodrugs, 2020, 34: 11-26）。因此，已开发了使用单克隆抗体的抗原结合位点来生成具有较小的分子大小的多肽的技术平台。

3、在该情景下，单结构域抗体（也以缩写vhh为人所知）是自然界中存在的最小抗体片段（15-17 kda），其能够特异性地识别抗原。它们源自骆驼科动物的重链抗体的可变区。此外，这些多肽抗高温、极端ph和蛋白酶（muyldermans, febs j, 2021, 288: 2084-102）。vhh的小尺寸对于治疗来说可能是一个缺点。然而，vhh在水性环境中的高功效和溶解度、在组织和肿瘤中的大的可穿透性以及优异的安全特性和低的免疫原性使得它们在各种免疫学应用中具有前景（sun等人, int j nanomedicine, 2021, 16: 2337-56）。

4、在近十年中，vhh在不同的科学研究领域中显现出了其潜力（jovčevska和muyldermans, biodrugs, 2020, 34: 11-26）。最近，首个vhh得到批准用于在人中使用，并且其他两种多肽处于ii和iii期临床试验中（scully等人, new england journal ofmedicine, 2019, 380: 335-46）。其他多肽进展到临床前和临床试验的不同阶段。

5、噬菌体展示技术允许严格和有效的选择，其在几周内从大的和多样的文库中回收多种高亲和力多肽（mccafferty等人, nature, 1990, 348: 552-4）。为了选择vhh，可以采用三种类型的文库：免疫文库、非免疫（幼稚）文库和合成文库。其中，仅合成文库可以提供可靠的通用文库，其使得能够获得对于几乎任何抗原来说特异性的vhh（knappik等人,journal of molecular biology, 2000, 296: 57-86）。

6、近年来，生成、选择和评价了各种vhh或源自其的多肽，其具有对于血管发生过程的调制剂的特异性。越来越多的研究将在对于抗-vegf/vegfr药物的抗性机制中的主导作用归因于bfgf/fgfr轴。然而，迄今为止还不存在有特异于bfgf的vhh（wang等人,molecular cancer therapeutics, 2012, 11: 864-72；ronca等人, expert opin. ther.targets 2015, 19: 1-17；zahra等人, cancers (basel), 2021, 13: 1422）。

7、考虑到vegf在血管发生过程中的基础作用，已专门从骆驼科动物的免疫文库开始生成了特异于vegf的vhh（farajpour等人, journal of biomolecular screening, 2014,19: 547-55；ebrahimizadeh等人, applied biochemistry and biotechnology, 2015,176: 1985-95；kazemi-lomedasht等人, molecular immunology, 2015, 65: 58-67）。这些vhh已显现出其对于内皮细胞增殖和管状结构形成的抑制效应，并且在它们中的一个中，证实了其在tc-1模型中的抗肿瘤效应。这些vhh识别处于变性构象的vegf，因此它们应当特异于线性区段，这是使得它们类似于贝伐珠单抗的一个要素（kazemi-lomedasht等人,iranian journal of basic medical sciences, 2017, 399-496）。

8、对于这些多肽的以后开发的基本缺点，除了放射性或荧光标记外，涉及：

9、a) 源自骆驼科动物的序列的可能抗原性，

10、b) 其低的分子量，这由于通过肾途径的快速消除而限制了生物利用率，

11、c) 病理学状况的多因素性质，这指出了使用多于一种生长因子/受体系统作为靶标的必要性。

12、特异于vegf的vhh中仅一种经历了人源化过程（kazemi-lomedasht等人, iranianjournal of basic medical sciences, 2018, 21: 260-6）。迄今为止，还不了解该蛋白质在体内系统中的行为。存在有至少一种已部分地人源化并且构成称为bi836880的双特异性构建物的一部分的抗-vegf vhh（kovalchuk等人, clinical & experimentalmetastasis, 2020, 37: 637-48）。这种vhh处于关于年龄相关的黄斑变性（armd）和关于晚期实体瘤的转移损伤的ii期临床研究中（www.http//clinicaltrials.gov）。

13、为了增加特异于其他分子靶标的vhh的大小，已描述了二价的、单或双特异性的多肽，其还掺入了对于血清蛋白质（例如白蛋白）的结合位点，或者免疫球蛋白igg1、igg2和igg4的fc区段。对于vegf或bfgf，尚未描述向vhh类型结合位点掺入免疫球蛋白的fc或对于其他蛋白质的结合位点的策略。

14、迄今为止，尚未描述使用bfgf作为靶标的人源化的单或双特异性的多价vhh类型的多肽，并且仅两种方法使用特异于vegf的经部分地人源化的vhh。另外，上面所讨论的策略中没有一个利用可以通过使用人源化合成文库而生成的多样性。

15、因此，仍然需要获得具有新的和特异于人vegf和bfgf的结合位点的治疗变体，其显示出增加的抗血管发生、抗肿瘤、抗转移、抗炎和免疫恢复效应。这允许在其生物利用率和组织接近方面的额外改善。

技术实现思路