同时定性并定量五种病原的引物组和检测方法及其应用与流程

1.一种同时定性并定量五种病原的引物组，其特征在于，所述的五种病原为ehp、div1、hhnv、wssv和vahpnd，所述的ehp为虾肝肠胞虫、div1为十足目虹彩病毒1、ihhnv为传染性皮下和造血组织坏死病毒、wssv为白斑综合症病毒、vahpnd为致急性肝胰腺坏死病弧菌，所述引物组的具体序列如seq id no.1-10。

2.一种同时定性并定量多种病原的多重evagreen荧光定量检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1所述的引物组。

3.权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂盒在同时定性并定量多种病原中的应用，其特征在于，所述的多种病原为ehp，div1，ihhnv，wssv和vahpnd，所述的应用为非疾病诊断和治疗的目的。

4.一种同时定性并定量多种病原的多重evagreen荧光定量检测方法，其特征在于，所述检测非疾病诊断和治疗目的，所述的病原为ehp，div1，ihhnv，wssv和vahpnd，所述方法具体包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的通过扩增曲线分析检测样品中是否含有ehp，div1，ihhnv，wssv和vahpnd，具体为：若阴性对照无扩增曲线，阳性对照出现扩增曲线，并ct值≤37，则判定试验有效；否则试验无效，应重新进行试验；若样品的ct值≤37，则判定检测结果为样品中存在ehp，div1，ihhnv，wssv和vahpnd；若37＜样品的ct值≤40时，应对样品再次检测；再次检测时加入2.5 μl模板，并相应减少水的体积，若再次检测样品出现扩增曲线，并ct值≤37，判定rt-qpcr检测结果为样品中存在ehp，div1，ihhnv，wssv和vahpnd，否则判定为阴性；若样品无扩增曲线，结果判定检测结果为阴性。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，熔解曲线出现峰，若tm值与ehp阳性对照tm值相同，则样品中含有ehp；若tm值与wssv阳性对照tm值相同，则样品中含有wssv；若tm值与vahpnd阳性对照tm值相同，则样品中含有vahpnd；若tm值与ihhnv阳性对照tm值相同，则样品中含有ihhnv；若tm值与div1阳性对照tm值相同，出现峰则样品中含有div1；若熔解曲线出现两峰及以上，则出现峰与对应阳性对照峰tm值相同则该样品含有相应病毒，若熔解曲线未出现峰值则该样品不含有ehp、div1、ihhnv、wssv、vahpnd五种病原。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的evagreen 荧光定量反应体系总体积25 μl，包括2×含evagreen的混合液 12.5 μl，引物ehp-2-f和ehp-2-r各0.56 μm，引物ihhnv-p-3f、ihhnv-p-3r、wssv-y-2f和wssv-y-2r各0.40 μm，引物div1-m-4f、div1-m-4r、vp-pb-3f、vp-pb-3r各0.32 μm，基因组dna模板1 μl，余量为去离子水。

8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的evagreen 荧光定量反应的反应条件为：95℃ 3min；95℃ 10s，64℃ 20s，40个循环；95℃ 15s，64℃ 1min，68℃-85℃收集熔解曲线。