一种植物分生组织细胞快速获取方法与流程

本发明涉及植物分生组织细胞获得，具体涉及一种植物分生组织细胞快速获取方法。

背景技术：

1、植物分生组织是在植物体内具有持续或周期性分裂能力的未分化细胞群，这些细胞通过分裂和分化，不断为植物体的生长和发育提供新的细胞。分生组织是产生和分化其他各种组织的基础，使植物体能够终生增长。

2、1)植物分生组织根据其位置可以分为顶端分生组织和侧生分生组织。

3、顶端分生组织：位于根、茎及其分枝顶端，负责根、茎的伸长和侧根、侧枝、新叶、生殖器官的形成。

4、侧生分生组织：纵贯根、茎，位于其周围靠近器官边缘的部分，如维管形成层和木栓形成层，负责根和茎的增粗。

5、2)植物分生组织根据来源分类可以分为原生分生组织、初生分生组织和次生分生组织。

6、原生分生组织：在植物胚胎期就已形成的分生组织。

7、初生分生组织：由原生分生组织衍生而来，位于根或茎的顶端一定距离处。

8、次生分生组织：由已经分化的细胞恢复分裂能力而形成，如维管形成层。

9、目前，植物分生组织细胞(plant stem cells，或cambial meristematice cells,cmcs)获取主要通过无菌操作，将离体的植物器官或组织置于含有营养物质和植物生长调节剂的培养基中，进行连续的培养。一般需要经历外植体获取，固体诱导培养，固体增殖培养，悬浮培养，摇瓶扩繁，以及5l、10l、20l、50l、200l、500l和1000l罐逐级的扩繁，一般需要经历5～10年的时间才能达到工业及应用规模。其中外植体获取，固体诱导培养，固体增殖培养，悬浮培养和摇瓶扩繁阶段一般需要1～2年的时间，5l、10l、20l、50l、200l、500l和1000l罐逐级的扩繁一般需要2～8年的时间。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种植物分生组织细胞快速获取方法。

2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

3、第一方面，本发明提供了一种植物分生组织细胞快速获取方法，包括以下步骤：

4、a、取新鲜植物的待处理部位洗净、切块，加入渗透液进行粉碎，得混合物1；

5、b、将混合物1放置在摇床上振荡16-24h，得混合物2；

6、c、将混合物2用20-30目筛网过滤，然后用水洗涤滤渣，收集过滤滤液和水洗涤滤渣的溶液，得过滤液1；

7、d、将过滤液1经过滤或离心处理，收集水洗涤后的过滤滤渣或离心沉淀物，得植物分生组织细胞。

8、作为优选方案，步骤a中，所述渗透液为蔗糖、甘油、山梨醇、甘露醇、纤维素、聚乙二醇中的至少一种；渗透液的浓度为0.5-2.0mol/l。

9、作为进一步的优选方案，所述渗透液为蔗糖、甘油和山梨醇的组合；更优选蔗糖、甘油和山梨醇的浓度各为0.6mol/l。

10、作为优选方案，步骤a中，所述粉碎采用的剪切速度为1～500r/s，粉碎时间为1s～30s。

11、作为进一步的优选方案，所述粉碎采用的剪切速度为1～400r/s，粉碎时间为20s～30s。最优选粉碎采用的剪切速度为22000r/min，粉碎时间为30s。

12、作为优选方案，步骤b中，所述摇床的温度为10-30℃、转速为0-300r/min。作为优选方案，步骤d中，所述过滤的方法为：过滤液1经50-500目的滤布过滤，或过滤液1经不同孔径的切向流过滤；所述滤布目数的选择是根据不同植物、不同部位的植物分生组织细胞的直径来选择，滤布的目数需小于单个植物分生组织细胞的直径，由此即可将植物分生组织截留在滤渣中。

13、作为优选方案，步骤d中，所述离心采用的转速为100～4000rpm。

14、作为优选方案，步骤b中，步骤d中，所述过滤液1经150目、200目或400目中的至少一种滤布过滤。

15、作为优选方案，所述经150目、200目或400目的滤布过滤时，所得滤渣均用水洗涤4-6遍。

16、本发明通过先采用20-30目筛网过滤去除破碎不完全组织，再进行过滤或离心去除破碎的细胞杂质，由此达到分离的目的，从而将团聚的植物分生组织或单个的植物分生组织截留在过滤滤渣或离心沉淀物中。

17、作为优选方案，所述方法还包括纯化的步骤，具体方法为：将步骤d获得的植物分生组织细胞加入纯化液处理，5～30min，过滤或离心处理，用水洗涤5遍，收集水洗涤后的过滤滤渣或离心沉淀物，得纯化后的植物分生组织细胞；

18、其中，所述纯化液为次氯酸钠、氢氧化钠中的至少一种，纯化液的质量浓度为0.1％～20％。

19、作为优选方案，步骤a中，所述植物包括人参、蓝果忍冬、水飞蓟、肉苁蓉、余甘子、覆盆子、当归、可可、番石榴、千蕨菜、虾脊兰、牛膝、积雪草、阳桃、黑果枸杞、赤芍、香桃木、沙冬青、锁阳、海南龙血树、三七、罗勒、降香、豌豆、甘草、中华猕猴桃、香槟玫瑰、巴戟天、神香草、黄连、黄柏中的任一种。

20、作为优选方案，所述待处理部位包括根、茎、叶、叶柄、根状茎、假鳞茎、果、苗、种子、全草中的至少一种。

21、作为优选方案，步骤a中，所述新鲜植物的待处理部位包括人参根、蓝果忍冬根、蓝果忍冬茎、水飞蓟根、水飞蓟茎和叶、肉苁蓉根、余甘子茎和叶、覆盆子根、当归根、可可叶、千蕨菜根、千蕨菜叶、虾脊兰假鳞茎、虾脊兰叶、牛膝根、积雪草全草、阳桃果、黑果枸杞根、黑果枸杞茎、赤芍根、香桃木根、香桃木茎、香桃木叶、沙冬青种子、锁阳根、海南龙血树芽、海南龙血树芽叶、三七叶、三七茎、三七根、罗勒根、罗勒茎、罗勒叶、降香根、降香茎、降香叶、豌豆苗、甘草根、中华猕猴桃根、中华猕猴桃茎、香槟玫瑰叶、巴戟天叶、神香草茎和叶、黄连叶和叶柄、黄柏根中的至少一种。

22、第二方面，本发明还提供了一种根据前述的方法获得的植物分生组织细胞。

23、与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

24、1、本发明开发了一种从植物中直接分离得到植物cmcs的快速方法，无需经历扩繁培养阶段，省去了培养步骤，节约了大量的培养时间，即可在短时间内(2天)获得大量植物cmcs。

25、2、本发明获得的植物cmcs纯度可达到60％及以上，后续可直接进行有效成分提取。

26、3、本发明的方法适用于大多数植物的分生组织细胞获得，具有普适性，且操作简单，对于获取容易且来源广泛的植物提取部位，采用本发明方法非常容易实现工业化生产。

1.一种植物分生组织细胞快速获取方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的植物分生组织细胞快速获取方法，其特征在于，步骤a中，所述渗透液为蔗糖、甘油、山梨醇、甘露醇、纤维素、聚乙二醇中的至少一种；渗透液的浓度为0.5-2.0mol/l。

3.根据权利要求1所述的植物分生组织细胞快速获取方法，其特征在于，步骤a中，所述粉碎采用的剪切速度为1～500r/s，粉碎时间为1s～30s。

4.根据权利要求1所述的植物分生组织细胞快速获取方法，其特征在于，步骤b中，所述摇床的温度为10-30℃、转速为0-300r/min。

5.根据权利要求1所述的植物分生组织细胞快速获取方法，其特征在于，步骤d中，所述过滤的方法为：过滤液1经50-500目的滤布过滤，或过滤液1经不同孔径的切向流过滤；

6.根据权利要求5所述的植物分生组织细胞快速获取方法，其特征在于，步骤d中，所述过滤液1经150目、200目或400目中的至少一种滤布过滤。

7.根据权利要求6所述的物分生组织细胞快速获取方法，其特征在于，所述经150目、200目或400目的滤布过滤时，所得滤渣均用水洗涤4-6遍。

8.根据权利要求1所述的植物分生组织细胞快速获取方法，其特征在于，所述方法还包括纯化的步骤，具体方法为：将步骤d获得的植物分生组织细胞加入纯化液处理5～30min，然后过滤或离心处理，收集水洗涤后的过滤滤渣或离心沉淀物，得纯化后的植物分生组织细胞；

9.根据权利要求1所述的植物分生组织细胞快速获取方法，其特征在于，步骤a中，所述植物包括人参、蓝果忍冬、水飞蓟、肉苁蓉、余甘子、覆盆子、当归、可可、番石榴、千蕨菜、虾脊兰、牛膝、积雪草、阳桃、黑果枸杞、赤芍、香桃木、沙冬青、锁阳、海南龙血树、三七、罗勒、降香、豌豆、甘草、中华猕猴桃、香槟玫瑰、巴戟天、神香草、黄连、黄柏中的任一种；

10.一种根据权利要求1-9任一项所述的方法获得的植物分生组织细胞。