一种韭菜子均一多糖、制备方法及在制备药物中的应用

本发明涉及韭菜子均一多糖，具体为一种韭菜子均一多糖、制备方法及在制备药物中的应用。

背景技术：

1、韭菜子为百合科植物韭菜allium tuberosum rottl.ex spreng的干燥成熟种子，秋季果实成熟时采收果序，晒干，搓出种子，除去杂质，其本草记载始见于《名医别录》。该种性温、味甘，归肝、肾经，有温补肝肾，壮阳固精之效。韭菜子中主要含有生物碱类、核苷类、甾体皂苷、挥发油类、不饱和脂肪酸类等化学成分。目前对韭菜子的研究主要集中在小分子活性物质，尤其是皂苷、抗氧化肽、总黄酮等。魏贤勇等从韭菜子中分离出27中甾体皂苷经体外生物学测定，结果表明对大鼠间质细胞的睾酮产生有促进作用。多糖是韭菜子的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗衰老、提高机体免疫力等功效。

2、参考现有文献食品科学技术学报2021,39(02),134-142中尹国友等人研究表明，在聚乙二醇相对分子质量6000,聚乙二醇质量分数14.50％，硫酸铵质量分数20.46％条件下韭菜籽粕多糖的萃取率为85.39％，在此条件下韭菜籽粕多糖体外抗氧化活性随着质量浓度的提高逐渐增强。

3、参考中国专利公开号为cn115487263b的一种抑制6-磷酸葡萄糖脱氢酶的韭菜子提取物的制备方法，通过选择以韭菜子为研究对象，通过对原料的处理、提取、纯化、体外活性筛选，进一步从韭菜子中获得g6pd抑制组分，为研究韭菜子抗肿瘤机理及开发抗肿瘤药物提供方法及理论依据。

4、综合分析以上现有技术存在以下缺陷：

5、1)现有技术未对韭菜子提取物中的有效部分的组分和功效进行详细研究，例如参考现有文献食品科学技术学报2021,39(02),134-142中虽然指出韭菜子的提取物为多糖组成，但未公开具体多糖组成和结构式，并且未提供针对韭菜子提取物的具体功效测试和印证，还例如参考专利cn115487263b的一种抑制6-磷酸葡萄糖脱氢酶的韭菜子提取物的制备方法，虽然其进行韭菜子提取物在抑制g6pd酶活性上进行具体实验和测定，但并未公开韭菜子提取物的具体组分，也未针对韭菜子提取物在激活免疫细胞中的功效进行具体实验测定，现有技术不能对韭菜子提取物结构进行精准鉴定。

6、2)现有的韭菜子提取物在制备过程中虽然分别采用溶解、浓缩、纯化和再浓缩的操作，但是在制备纯度仍然相对较低，例如参考专利cn115487263b的一种抑制6-磷酸葡萄糖脱氢酶的韭菜子提取物的制备方法，虽然通过石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，然后通过大孔吸附树脂采用乙醇进行梯度洗脱，但并未给出具体的萃取步骤，而本发明通过采用sevag试剂进行多次分级脱蛋白处理，来大大提升了韭菜子均一多糖的制备纯度，同时不能实现通过采用阴离子纤维素柱及凝胶柱多重洗脱纯化步骤进行处理分离出均一多糖，

7、3)现有技术未对韭菜子提取物在调节免疫系统的功效进行具体实验测定，不能判定韭菜子提取物可以激活巨噬细胞和诱导细胞免疫因子表达的功能。

技术实现思路

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了一种韭菜子均一多糖、制备方法及在制备药物中的应用，现有技术未对韭菜子提取物中的有效部分的组分和功效进行详细研究，不能对韭菜子提取物结构进行精准鉴定，并且现有的韭菜子提取物在制备过程中虽然分别采用溶解、浓缩、纯化和再浓缩的操作，但是制备纯度仍然相对较低，不能实现通过采用阴离子纤维素柱及凝胶柱多重洗脱纯化步骤进行处理分离出均一多糖，同时现有技术未对韭菜子提取物在调节免疫系统的功效进行具体实验测定，不能判定韭菜子提取物可以激活巨噬细胞和诱导细胞免疫因子表达的功能。

3、(二)技术方案

4、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

5、第一方面，本发明提供了一种韭菜子均一多糖，包括甘露糖、葡萄糖和阿拉伯糖组成，所述韭菜子均一多糖为葡甘聚糖，且葡甘聚糖的糖苷链是由araf-1、araf-1-5、glcp-1、manp-1-4、glcp-1-4和manp-1-4-6组成，所述韭菜子均一多糖的分子质量为1-40kda。

6、第二方面，本发明还提供了一种韭菜子均一多糖的制备方法，具体包括以下步骤：

7、s1、依次将干燥后的韭菜子粉碎、热水提取、乙醇沉淀、脱蛋白和干燥获得韭菜子多糖粗品；

8、s2、对步骤s1中获得的韭菜子多糖粗品用蒸馏水溶解后，上清液经阴离子纤维素层析柱进行层析处理，再利用nacl溶液梯度洗脱，然后采用苯酚硫酸法检测，获得韭菜子水洗组分多糖；

9、s3、将步骤s2中获得的韭菜子水洗组分多糖用凝胶柱进行纯化，根据出峰位置收集有效部位，然后经浓缩透析和冷冻干燥后得到纯度至少为99％的韭菜子均一多糖。

10、优选的，所述步骤s1的具体操作步骤如下：

11、t1、首先对干燥韭菜子用粉碎机粉碎至均匀韭菜子粗粉；

12、t2、取步骤t1的韭菜子粗粉加入到清水中，先煮沸，再在煮沸条件下提取2-5次，合并浓缩；

13、t3、将步骤t2提取浓缩后的韭菜子混合液进行离心处理，离心时以4000r/min的转速，离心10min，收集上清液；

14、t4、向步骤t3收集的上清液中加入4倍体积的质量分数为90-100％的乙醇，直至乙醇最终质量分数为80-95％，然后在4℃的条件下静置过夜，收集沉淀，获得韭菜子多糖浓缩物；

15、t5、将步骤t4收集韭菜子多糖浓缩物配制为水溶液，利用sevag试剂依次进行3-5次脱蛋白操作，收集每次脱蛋白后的上清液，将收集的上清液浓缩冻干后，即得到韭菜子多糖粗品。

16、优选的，所述步骤t2中提取时韭菜子粉末与水的物料比为1:8-1:20(g/ml)，加热提取的温度为80-100℃，每次提取时间为1-5h。

17、优选的，所述步骤t5中sevag试剂是由氯仿和正丁醇按照4:1的配比配制而成。

18、优选的，所述步骤t5利用sevag试剂依次进行3-5次脱蛋白操作过程具体为：第一次加入等体积的sevag试剂，超声混匀20min，在转速为4000r/min的条件下离心5min，保留上清，剩余脱蛋白操作均加入1/4体积的sevag试剂，超声混匀20min，在转速为4000r/min的条件下离心处理5min。

19、优选的，所述步骤s2中阴离子纤维素层析柱是采用型号为de-52的纤维素层析柱。

20、优选的，所述步骤s2中nacl溶液的浓度为0.2-1mol/l。

21、第三方面，本发明还提供了一种通过韭菜子均一多糖的制备方法制备的韭菜子均一多糖在制备激活免疫细胞药物中的应用方法，具体包括以下步骤：

22、e1、巨噬细胞培养：将raw264.7细胞培养在dmem培养基中，培养基中预先加入10％胎牛血清、青霉素和链霉素，在37℃和5％co2的培养箱中进行过夜培养；

23、e2、测定细胞因子：将步骤e1过夜培养的巨噬细胞进行分组，分别分成空白对照组(0μg/ml)、lps脂多糖组及在0.39-1.56μg/ml不同浓度的韭菜子均一多糖样品培养24h，收集培养液，利用elisa法测定白细胞介素il-6的含量，然后将测定结果制成统计图；

24、e3、根据步骤e2制成的统计图进行对比分析，结果显示韭菜子多糖显著促进白细胞介素il-6的表达，并且在菜子均一多糖浓度为0.78μg/ml时达到最大值，因此证明韭菜子多糖具有免疫激活作用；

25、e4、将韭菜子均一多糖作为原料制备激活免疫细胞的药物。

26、优选的，所述步骤e1中青霉素和链霉素的含量均为100u/ml。

27、(三)有益效果

28、本发明提供了一种韭菜子均一多糖、制备方法及在制备药物中的应用。与现有技术相比具备以下有益效果：

29、(1)、该韭菜子均一多糖、制备方法及在制备药物中的应用，通过对韭菜子提取物结构进行精准鉴定，精准鉴定出韭菜子的提取物为韭菜子均一多糖，包括甘露糖、葡萄糖和阿拉伯糖组成，韭菜子均一多糖为葡甘聚糖，且葡甘聚糖的糖苷链是由araf-1、araf-1-5、glcp-1、manp-1-4、glcp-1-4和manp-1-4-6组成，韭菜子均一多糖的分子质量为1-40kda。

30、(2)、该韭菜子均一多糖、制备方法及在制备药物中的应用，通过采用sevag试剂进行多次分级脱蛋白处理，来大大提升了韭菜子均一多糖的制备纯度，同时实现了通过采用阴离子纤维素柱及凝胶柱多重洗脱纯化步骤进行处理分离出均一多糖，制得韭菜子均一多糖的纯度在99％以上。

31、(3)、该韭菜子均一多糖、制备方法及在制备药物中的应用，通过采用水提醇沉法，利用阴离子纤维素柱及凝胶柱，首次从韭菜子中分离出均一多糖，所制备的韭菜子均一多糖具有调节免疫系统的功效，可以激活巨噬细胞，诱导细胞免疫因子表达。