用于产生具有单链粘端的双链DNA片段的异源双链体热稳定性连接组装(HTLA)和/或环状异源双链体热稳定性连接组装(CHTLA)

1.一种形成具有5'或3'突出端的粘端块(seb)的方法，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述缓冲介质的ph为约6.0至约9。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述缓冲介质包含tris-hcl、mgcl2、kcl、nad、dtt和triton x-100。

4.根据权利要求1所述的方法，其中用于熔融的温度由所述序列的大小决定并且在约37℃至100℃的范围内。

5.根据权利要求1所述的方法，其中用于熔融的加热时间段在30秒至10分钟的范围内。

6.根据权利要求1所述的方法，其中退火在比所述熔融温度低5℃至40℃的温度下进行。

7.根据权利要求1所述的方法，其中用于退火的时间段为约4分钟至10分钟。

8.根据权利要求1所述的方法，其中前体dna片段的大小为长度在约20个核苷酸至数千个核苷酸的范围内，并且可以是单链或双链的。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述缓冲介质包含tris-hcl、mgcl2、kcl、nad、dtt和triton x-100，ph为约7.5至约8，其中熔融温度高于约80℃，持续约3分钟，其中退火温度比所述熔融温度低约10℃至20℃并且持续约4分钟至6分钟，其中熔融、退火和连接的步骤在2次至12次的范围内进行多次以产生钝端产物。

10.根据权利要求1所述的方法，其中熔融、退火和连接的步骤在2次至30次的范围内进行多次以产生粘端产物。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述粘端序列可以用t4连接酶连接，以得到更长的延伸序列。

12.根据权利要求9所述的方法，其中前体dna片段的大小为长度在约20个核苷酸至数千个核苷酸的范围内，并且可以是单链或双链的。

13.根据权利要求9所述的方法，其中与熔融、退火和连接相关的温度在约95℃至约60℃的较低温度的范围内，持续一个、两个、三个或更多个循环。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所定义的dna序列包含一个或多个随机或可变核苷酸。

15.一种形成粘端异源双链体dna与钝端dna产物的混合物的方法，所述方法包括：

16.根据权利要求15所述的方法，其中通过使用能够连接粘端并形成延伸核苷酸序列和/或环状dna的dna连接酶进一步连接粘端互补dna序列。