一种快速偶联蛋白的方法与流程

本发明涉及生物，具体涉及一种快速偶联蛋白的方法。

背景技术：

1、蛋白偶联是蛋白质通过化学共价键结合1个或多个分子的过程。该技术一般利用多种化学试剂进行蛋白偶联。偶联试剂含有具有反应活性的末端，可与蛋白分子上的特定功能基团(如伯氨基、巯基)反应。常用偶联试剂一般包括：n-羟基琥珀酰亚胺酯，亚氨酸酯碳二亚胺，马来酰亚胺，卤代乙酰基，吡啶二巯基，醛基，酰肼，烷氧基胺，环氧等。但这些偶联试剂多用于修饰氨基酸侧链，会封闭蛋白活性位点，使蛋白功能基团失活或改变特性。基于上述问题的，部分技术人员会选择酶法进行蛋白偶联，例如转肽酶sortase酶，虽然sortase酶可以实现c端定点偶联，不会修饰氨基酸侧链，但反应效率低，需多个小时才能完成反应。

2、内含肽是前体未成熟蛋白中的一段多肽链，它通过一系列重排、转酯、环化等自我催化的反应过程，可以从前体蛋白中切除并将两端的蛋白多肽链通过一个天然的肽键连接。本发明中涉及的蛋白偶联配基和蛋白偶联标签分别是点形念珠藻属dnae内含肽的n端和c端部分。该内切肽n端和c端具有极强的相互识别能力，两者很强的亲和结合是该蛋白偶联方法的基础。然而当n端部分和c端部分结合后会恢复内含肽结构，会引发剪接反应，造成蛋白偶联标签与目标蛋白之间断裂，导致目标蛋白脱落，因此期望降低该内切肽的剪接反应，从而防止偶联的目标蛋白的脱落。

技术实现思路

1、以往的蛋白偶联方法会使目标蛋白失活或是反应效率很低反应时间很长，寻求一种快速稳定的蛋白定点偶联方法。本发明提供可以快速偶联蛋白并能保证蛋白活性的方法，包含蛋白配基和经过人工改造的蛋白偶联标签以及偶联配基的固相载体。

2、为了解决上述问题，本发明提供的技术方案如下：

3、一种快速偶联蛋白的方法，将包含蛋白偶联标签的目标蛋白结合到已经偶联到固相载体的蛋白配基上，进而将目标蛋白偶联到固相载体上。

4、包含蛋白偶联标签的目标蛋白可以迅速特异性结合到已经偶联到固相载体的蛋白配基上，进而间接的将目标蛋白偶联到固相载体上。该快速偶联蛋白的方法，目标蛋白通过n端的蛋白偶联标签偶联而不是通过氨基酸残基偶联，是一种蛋白定点偶联的方法。

5、本发明的第一目的在于提供了一种蛋白偶联配基及对应的人工改造的蛋白偶联标签。

6、所述的蛋白偶联配基由序列号seq id no.2所示的氨基酸序列具有至少85％的同源性的氨基酸序列构成。

7、所述的一种用于蛋白偶联的配基，其中，所述的蛋白偶联配基为seq id no.2所定义的97个氨基酸的蛋白质。

8、所述的蛋白偶联标签由序列号seq id no.1所示的氨基酸序列具有至少85％同源性的氨基酸序列构成。

9、所述的人工改造的蛋白偶联标签为seq id no.1所定义的37个氨基酸的亲本蛋白偶联标签的突变体，所述突变选自亲本蛋白偶联标签c端2个氨基酸，第36位氨基酸为脯氨酸或其他非极性氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸)，第37位氨基酸为脯氨酸或是亲水氨基酸(甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，半胱氨酸等)，与亲本分子(seq id no.1)相比，该突变赋予了带有此蛋白偶联标签的目标蛋白与配基不易解离的特性。

10、2个经过人工改造的蛋白偶联标签突变体为seq id no.3和seq id no.4，与亲本分子(seq id no.1)相比，该突变赋予了带有此蛋白偶联标签的目标蛋白与配基不易解离的特性。

11、一种用于蛋白质定点偶联的基质，其中由上述用于偶联蛋白的配基已偶联于固相载体上。

12、优选的，固相载体为微球等，在本领域中并不是唯一的。

13、一种快速偶联蛋白的方法，其中使用所述的蛋白偶联标签和蛋白偶联配基以及其偶联的固相载体。

14、一种使用所述的偶联蛋白的固相载体。

15、一种使用所述快速偶联蛋白的方法。

16、本发明的有益效果在于本发明提供快速偶联蛋白，保证了偶联后目标蛋白的活性，而且偶联后的蛋白非常稳定不易脱落。本发明所述蛋白偶联方法不会修饰侧链氨基酸，而且反应高效1分钟内就可以完成偶联反应，避免了化学偶联试剂或是酶法的缺点。

1.一种快速偶联蛋白的方法，其特征在于，将包含蛋白偶联标签的目标蛋白结合到已经偶联到固相载体的蛋白配基上，进而将目标蛋白偶联到固相载体上。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白通过n端的蛋白偶联标签偶联。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白偶联标签由与seq id no.1的所示的氨基酸序列具有至少85％的同源性的氨基酸序列构成。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白偶联标签为seq id no.1所定义的37个氨基酸的亲本蛋白偶联标签的突变体，所述突变选自c端2个氨基酸，第36位氨基酸为脯氨酸或其他非极性氨基酸，第37位氨基酸为脯氨酸或亲水氨基酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述其他非极性氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸；所述亲水氨基酸为甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，半胱氨酸。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述蛋白偶联标签突变体序列号为seq idno.3和seq id no.4。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白配基由与seq id no.2的所示的氨基酸序列具有至少85％的同源性的氨基酸序列构成。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述蛋白配基为seq id no.2所定义的97个氨基酸的蛋白质。

9.一种用于蛋白质定点偶联的基质，其中包括由权利要求8的用于偶联蛋白的配基已偶联于固相载体上。

10.一种使用如权利要求1所述的偶联目标蛋白的固相载体。