一种嗜渗酵母菌检测引物组及其试剂盒的制作方法

本申请涉及微生物检测，具体涉及一种嗜渗酵母菌检测引物组及其试剂盒。

背景技术：

1、蜂蜜是一种具有较高营养价值的保健食品。有抗菌活性和免疫调节功能。由于蜂蜜的高渗透压，一般的微生物无法在其中生存，仅有少量的耐高渗的酵母菌。comi等研究表明，当蜂蜜中含水量小于18％、初始酵母含量低于100cfu/g条件下能抑制嗜渗酵母的生长。蜂蜜中出现的酵母主要有两类：一类为嗜渗酵母(osmophilic yeast)，另一类为耐高糖酵母(sugar-tolerantyeasts)，其中嗜渗酵母对蜂蜜品质影响较大。文献报道常见的嗜渗酵母主要由孢酵母属(nematospora)、裂殖酵母属(schizosaccharomyces)、圆酵母属(torula)和接合酵母属(zygosaccharomyces)。接合酵母属也被认为是食品工业中最重要的腐败酵母菌之一。

2、目前，《食品安全国家标准蜂蜜》gb14963-2011附录了嗜渗酵母计数方法，但是传统培养可能需要几天到一周的孵育时间。erickson等人研制了拜耳接合酵母选择性培养基，但对鲁氏接合酵母和二孢接合酵母的选择性降低。国内食品生产加工企业目前一般采取平板计数法调查高渗酵母。传统的酵母鉴定方法虽然有效，但费时，费力，使检测结果落后于生产过程，增加生产成本。因此快速高效检测嗜渗酵母菌迫在眉睫。近年来，研究了许多基于仪器的快速检测方法逐渐增多，宋雅迪等人同时应用傅里叶红外光谱和傅里叶变换近红外光谱对高渗酵母的光谱扫描，建立高渗酵母判别模型，对24株未建模的高渗酵母光谱数据分析，区分正确率达到96.67％，但采集过程较复杂；电子鼻技术与化学计量学相结合对腐败酵母鲁氏接合酵母的早期检测也进行了报道。

3、分子生物学技术的发展，极大提高了食品微生物检测的特异性和时效性。pcr技术及其变体如实时荧光定量pcr(real time fluorescence quantitative pcr)，能在几小时内完成微生物的检测和定量。食品上对实时荧光定量pcr的应用主要集中在大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等细菌方面；在蜂蜜方面的研究主要集中在蜂蜜品种和蜜源鉴定方面。

4、因此，针对嗜渗酵母菌的基因序列设计引物，对hex探针荧光定量pcr反应条件进行优化，建立蜂蜜中嗜渗酵母菌快速诊断技术，为该菌的控制提供技术支撑，是目前重点的研究方向。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本申请提供一种嗜渗酵母菌检测引物组及其试剂盒，具体是通过以下技术方案得以实现的：

2、一种嗜渗酵母菌检测引物组，包含下列引物：

3、上游引物：ggaagggcatttgatcagaca；

4、下游引物tcctgccaccaaaactgatg。

5、一种嗜渗酵母菌hex探针，其具体探针序列如下：

6、探针序列：hex-ttttgtgcccctcgct。

7、所述的嗜渗酵母菌检测引物组以及所述的嗜渗酵母菌hex探针在检测嗜渗酵母菌方面的应用。本申请根据genbank中嗜渗酵母菌26s rdna d1/d2区基因序列设计引物，建立了蜂蜜中嗜渗酵母菌快速诊断技术，所得引物及探针可以用于检测嗜渗酵母菌方面，为该菌的控制提供技术支撑。

8、进一步的，所述检测嗜渗酵母菌，是检测蜂蜜中的检测嗜渗酵母菌。

9、进一步的，所述检测嗜渗酵母菌方面的应用，是制备嗜渗酵母菌检测试剂方面的应用，尤其是嗜渗酵母菌检测试剂盒。

10、一种嗜渗酵母菌检测试剂盒，包含下列引物序列及探针序列：

11、上游引物：ggaagggcatttgatcagaca；

12、下游引物tcctgccaccaaaactgatg。

13、探针序列：hex-ttttgtgcccctcgct。

14、进一步的，所述试剂盒是荧光定量pcr试剂盒，该试剂盒组成如下：上游引物10μl，下游引物10μl，探针5μl，阴性对照(超纯水)45μl；阳性对照(酵母菌dna)45μl；超纯水500μl，probe qpcr酶600μl。

15、一种蜂蜜中嗜渗酵母菌hex探针法荧光定量pcr检测方法，采用所述的引物序列及探针序列，使用荧光定量pcr方法进行检测。

16、与现有技术相比，本申请创造的技术效果体现在：

17、(1)本申请根据genbank中嗜渗酵母菌26s rdnad1/d2区基因序列设计特异性的引物，pcr扩增获得嗜渗酵母d1/d2区基因片段，构建重组质粒pmd–18t–jm，作为阳性标准品。

18、(2)本申请对hex探针荧光定量pcr反应条件进行优化，建立嗜渗酵母hex实时荧光定量pcr诊断方法，研制诊断试剂盒。

19、(3)本申请建立的方法对大肠杆菌标准株、沙门氏菌标准株、金黄色葡萄球菌标准株、志贺氏菌扩增，均无阳性信号扩增，重复性好，灵敏度可达0.004pg/μl。

20、(4)本申请建立的嗜渗酵母菌hex实时荧光定量pcr方法灵敏度高、特异性强、重复性好、操作简便快速，适合于蜂蜜中嗜渗酵母菌样品的检测，实时荧光定量pcr只需常规pcr检测时间的1/3(常规方法采用试剂盒提取dna后进行普通pcr需要5.5h，本研究采用水煮提取dna加上荧光定量检测需要110min)，且可对蜂蜜中渗酵母菌进行定量。

21、(5)本申请建立的嗜渗酵母菌hex实时荧光定量pcr方法检测准确率高，普通pcr检测结果阳性率84.09％，本申请建立的hex探针实时荧光定量pcr检测阳性率100％。

22、(6)本申请建立的嗜渗酵母菌hex实时荧光定量pcr方法能够精确检测蜂蜜中嗜渗酵母菌数量，评估蜂蜜产品品质和安全风险，并指导制定蜂蜜管理和控制措施，为评估蜂蜜产品质量提供重要参考依据。相应的嗜渗酵母菌hex实时荧光定量pcr试剂盒可应用于各种蜂蜜样品的检测，提高蜂蜜质量，促进养蜂业发展。

1.一种嗜渗酵母菌检测引物组，其特征在于，包含下列引物：

2.一种嗜渗酵母菌hex探针，其特征在于，其具体探针序列如下：

3.权利要求1所述的嗜渗酵母菌检测引物组或权利要求2所述的嗜渗酵母菌hex探针在检测嗜渗酵母菌方面的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测嗜渗酵母菌，是检测蜂蜜中的嗜渗酵母菌。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测嗜渗酵母菌方面的应用，是制备嗜渗酵母菌检测试剂方面的应用。

6.一种嗜渗酵母菌检测试剂盒，其特征在于，包含下列引物：

7.根据权利要求6所述的嗜渗酵母菌检测试剂盒，其特征在于，还含有探针：

8.根据权利要求6所述的嗜渗酵母菌检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒组成如下：上游引物10μl，下游引物10μl，探针5μl，阴性对照(超纯水)45μl；阳性对照(酵母菌dna)45μl；超纯水500μl，probe qpcr酶600μl。

9.根据权利要求6所述的嗜渗酵母菌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是荧光定量pcr试剂盒。

10.一种蜂蜜中嗜渗酵母菌hex探针法荧光定量pcr检测方法，其特征在于，采用权利要求1中所述的引物序列及权利要求2中所述探针序列，使用荧光定量pcr方法进行检测。