一种用于同时检测病原菌基因和耐药基因的引物组合物、检测方法及检测装置

本发明属于细菌检测，具体涉及一种用于同时检测病原菌基因和耐药基因的引物组合物、检测方法及检测装置。

背景技术：

1、老年脓毒症患者逐年增加，病死率超过30％。当前临床治疗上针对老龄脓毒症多采用抗菌药物，因此早期诊断和治疗对老年脓毒症患者指导用药显得尤其重要。脓毒症是一种与时间赛跑的综合征，混合感染严重，抗感染治疗是脓毒症治疗的核心措施，因此，快速、精准的临床即时诊断(poct)技术通过对老龄失能人群痰液、尿液、血液感染病原诊断检测至关重要。

2、目前，引起脓毒症的病原主要包括鲍曼不动杆菌、粪肠球菌等。鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)属于变形菌纲的不动杆菌属莫拉氏菌科的成员，是临床上重要革兰氏阴性需氧杆菌，由于具有高度的适应性、侵袭性、运动性，并能够定植生存于医院环境中，主要特点表现为在环境中具有很强的生存能力，严重制约抗菌药物的疗效。2017年who公布的急需解决耐药性细菌中，耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌位居榜首。该菌株可在各种环境中发现，包括土壤、水和食物，并经常从医疗设备中分离出来，且由于其定居和生活在许多医疗设备上，会导致免疫受损人群的严重感染，是脓毒症感染中常见病原之一。

3、粪肠球菌(enterococcusfaecalis)，肠球菌科，肠球菌属，是一种兼性厌氧型革兰氏阳性乳酸菌。粪肠球菌的菌体形态为球状或链状，直径大小，无荚膜，无芽孢，对环境适应力和抵抗力强，可耐受碳青霉烯类抗生素、四环素类等多种抗生素，生长条件要求不严格。

4、临床上脓毒症病原诊断常规采用分离培养、涂抹镜检、血清学检测、pcr、rt-pcr或二代测序等方法来检测，耗时较长，抗抑性差，成本较高，检测灵敏度有待加强。因此，亟需提供一种快速、高效、低成本、灵敏度高、抗抑性强的脓毒症诊断技术。

5、除此之外，脓毒症的发病病程急，且常见多病原菌混合感染，患者应尽快给予广谱抗生素治疗。每延迟1小时使用抗生素治疗，患者存活率平均下降7.6％；若24小时内未给予抗生素治疗，存活率将从80％大幅下降至10％。在临床治疗中，碳青霉烯类和四环素类抗生素是应对脓毒症细菌感染的关键药物。然而，随着抗生素药物的广泛使用，对这两类抗生素耐药的菌株不断涌现，成为临床上治疗脓毒症的重大障碍。因此，在检测脓毒症病原体的同时，若一并鉴定出致病菌株的耐药性，将有效地促进临床治疗的有效性。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供一种用于同时检测病原菌基因和耐药基因的引物组合物、检测方法及检测装置，本发明提供的引物组合物可以同时检测引起脓毒症的两种病原菌病原基因以及两种耐药基因，可便捷、快速、准确地检测出结果；检测方法效果更为优良，能够在40min内获得检测结果。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种用于同时检测病原菌基因和耐药基因的引物组合物，所述病原菌基因为鲍曼不动杆菌clor病原基因和粪肠球菌nyla病原基因，所述耐药基因为碳青霉烯类抗生素耐药基因kpc2和四环素类抗生素耐药基因tet(x4)，所述引物组合物包括如seq idno.1-20所示的核苷酸序列。

4、进一步的，用于检测所述鲍曼不动杆菌clor病原基因的引物组合物的核苷酸序列如seq id no.1-5所示。

5、进一步的，用于检测所述粪肠球菌nyla病原基因的引物组合物的核苷酸序列如seq id no.6-10所示。

6、进一步的，用于检测所述碳青霉烯类抗生素耐药基因kpc2的引物组合物的核苷酸序列如seq id no.11-16所示。

7、进一步的，用于检测所述四环素类抗生素耐药基因tet(x4)的引物组合物的核苷酸序列如seq id no.17-20所示。

8、进一步的，所述引物组合物还包括将如seq id no.1-20所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与所描述核苷酸序列具有相同功能的dna分子。

9、本发明还提供了一种用于同时检测病原菌基因和耐药基因的方法，所述方法包括利用所述的引物组合物通过环介导等温扩增方法进行检测的步骤。

10、进一步的，所述环介导等温扩增方法的反应条件为60-65℃恒温40min，所述用于检测鲍曼不动杆菌clor病原基因的引物组合物seq id no.1-5的摩尔浓度比为1：1：4-16：4-16：2-8；所述用于检测粪肠球菌nyla病原基因的引物组合物seq id no.6-10的摩尔浓度比为1：1：4-16：4-16：2-8；所述用于检测碳青霉烯类抗生素耐药基因kpc2的引物组合物seqid no.11-16的摩尔浓度比为1：1：4-16：4-16：2-8：2-8；所述用于检测四环素类抗生素耐药基因tet(x4)的引物组合物的摩尔浓度比为1：1：4-16：4-16。

11、本发明还提供了一种用于检测引起脓毒症的病原基因及耐药基因的检测装置，所述检测装置包括所述的引物组合物，所述检测装置包括试剂盒和/或基因芯片。

12、进一步的，所述检测装置的检测步骤包括：

13、(1)提取待测细菌或其他类型待检样品中基因组核酸；

14、(2)以步骤(1)提取的基因为模版，采用所述的引物组合物对鲍曼不动杆菌clor病原基因、粪肠球菌nyla病原基因、碳青霉烯类抗生素耐药基因kpc2以及四环素类抗生素耐药基因tet(x4)进行反转录和环介导等温扩增。

15、本发明所述的引物组合物可用于检测样本中是否含有病原菌：鲍曼不动杆菌、粪肠球菌，以及病原菌是否含有耐药基因：抗碳青霉烯类抗生素kpc2基因、抗四环素类抗生素tet(x4)基因。

16、应用上述引物组合物可以对样品中基因cdna模版特异性扩增，则待测样品中含有或疑似含有鲍曼不动杆菌、粪肠球菌的病原基因及抗碳青霉烯类抗生素kpc2基因、抗四环素类抗生素tet(x4)基因；如果不可以对样品中基因cdna模版特异性扩增，则待测样品中不含有鲍曼不动杆菌、粪肠球菌的病原基因及抗碳青霉烯类抗生素kpc2基因、抗四环素类抗生素tet(x4)基因。

17、本发明公开了以下技术效果：

18、本发明提供的用于检测引起脓毒症的常见病原菌病原基因及耐药基因的引物组合物，能够同时检测鲍曼不动杆菌、粪肠球菌的病原基因及抗碳青霉烯类抗生素kpc2基因、抗四环素类抗生素tet(x4)基因，可便捷、快速、准确的检测出结果，该方法特异性强，灵敏度高，能够在40min内获得检测结果。

19、本发明提供的检测方法中，采用的环介导等温扩增技术(lamp)具有快速、高效、低成本、灵敏度高、抗抑性强等特点，是面向高龄失能人群危急重症预防、诊疗、用药指导、预后养老的核心环节，是脓毒症诊断关键技术。

1.一种用于同时检测病原菌基因和耐药基因的引物组合物，其特征在于，所述病原菌基因包括鲍曼不动杆菌clor病原基因和粪肠球菌nyla病原基因，所述耐药基因包括碳青霉烯类抗生素耐药基因kpc2和四环素类抗生素耐药基因tet(x4)，所述引物组合物包括如seqidno.1-20所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的用于同时检测病原菌基因和耐药基因的引物组合物，其特征在于，用于检测所述鲍曼不动杆菌clor病原基因的引物组合物的核苷酸序列如seq idno.1-5所示。

3.根据权利要求1所述的用于同时检测病原菌基因和耐药基因的引物组合物，其特征在于，用于检测所述粪肠球菌nyla病原基因的引物组合物的核苷酸序列如seq id no.6-10所示。

4.根据权利要求1所述的用于同时检测病原菌基因和耐药基因的引物组合物，其特征在于，用于检测所述碳青霉烯类抗生素耐药基因kpc2的引物组合物的核苷酸序列如seqidno.11-16所示。

5.根据权利要求1所述的用于同时检测病原菌基因和耐药基因的引物组合物，其特征在于，用于检测所述四环素类抗生素耐药基因tet(x4)的引物组合物的核苷酸序列如seqidno.17-20所示。

6.根据权利要求1所述的用于同时检测病原菌基因和耐药基因的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物还包括将如seq id no.1-20所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与所描述核苷酸序列具有相同功能的dna分子。

7.一种用于同时检测病原菌基因和耐药基因的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1-6任一项所述的引物组合物通过环介导等温扩增方法进行检测的步骤。

8.根据权利要求7所述的用于检测引起脓毒症中常见病原菌感染的方法，其特征在于，所述环介导等温扩增方法的反应条件为60-65℃恒温40min，所述用于检测鲍曼不动杆菌clor病原基因的引物组合物seq id no.1-5的摩尔浓度比为1：1：4-16：4-16：2-8；所述用于检测粪肠球菌nyla病原基因的引物组合物seq id no.6-10的摩尔浓度比为1：1：4-16：4-16：2-8；所述用于检测碳青霉烯类抗生素耐药基因kpc2的引物组合物seq id no.11-16的摩尔浓度比为1：1：4-16：4-16：2-8：2-8；所述用于检测四环素类抗生素耐药基因tet(x4)的引物组合物的摩尔浓度比为1：1：4-16：4-16。

9.一种用于检测引起脓毒症的病原基因及耐药基因的检测装置，其特征在于，所述检测装置包括权利要求1-6任一项所述的引物组合物，所述检测装置包括试剂盒和/或基因芯片。

10.根据权利要求9所述的检测装置，其特征在于，所述检测装置的检测步骤包括：