甾体C1,2脱氢酶突变体及在合成醋酸环丙孕酮脱氢物中的应用的制作方法

本发明涉及酶改造，具体为甾体c1,2脱氢酶突变体及在合成醋酸环丙孕酮脱氢物中的应用。

背景技术：

1、醋酸环丙孕酮为抗雄激素类药物能治疗不能手术的前列腺癌，抑制女性机体所产生的雄激素的影响，从而可以治疗雄激素产生过多或对雄激素特殊敏感所致的疾病。对痤疮和皮脂溢发生起重要作用的皮脂腺功能的增加有抑制作用。醋酸环丙孕酮脱氢物，属孕激素醋酸环丙孕酮的前期中间体。

2、目前合成醋酸环丙孕酮脱氢物的工艺有两种；

3、一种是利用细胞发酵，将底物17α-oh黄体酮脱氢氧化为17α-oh黄体酮脱氢物，或者是利用细胞发酵，将底物17α-oh黄体酮6,7脱氢物氧化为三烯物，但是利用细胞发酵的方法都存在投料浓度较低(10～30g/l)，发酵周期较长(3-4天)且发酵过程需要严格控制无菌条件，工艺较为复杂等缺点；如中国专利文献cn117720608a；另一种工艺是利用化学合成，利用原甲酸三乙酯和对甲苯磺酸盐将17α-oh黄体酮反应为醚化物，再将醚化物在甲苯中，利用二氯二氰苯醌或者是四氯苯醌氧化为脱氢产物，该方法会用到大量有毒试剂，如甲苯等，具有一定的危险性，如中国专利文献cn103145785a，cn117624276a。

4、甾体c1,2脱氢酶(kstd)能催化甾体中a环发生的c1,2位脱氢反应，然而针对底物17α-oh黄体酮脱氢存在转化率低的缺陷，如果能够对其改造实现高转化率，则具有可观的应用前景。

技术实现思路

1、本发明提供了甾体c1,2脱氢酶突变体及在合成醋酸环丙孕酮脱氢物中的应用，通过改造野生型甾体c1,2脱氢酶得到活性较高的酶突变体，可用于酶催化制备醋酸环丙孕酮脱氢物，推进酶法合成的工业应用。

2、有鉴于此，本发明的方案为：

3、本发明的第一个方面，提出氨基酸序列如seq id no：3、4所示的甾体c1,2脱氢酶突变体。

4、本发明的第二个方面，提出编码上述第一个方面所述甾体c1,2脱氢酶突变体的基因。

5、可选地，编码上述甾体c1,2脱氢酶突变体的基因的核苷酸序列如seq id no：5、6所示。

6、本发明的第三个方面，提出表达载体，该表达载体含有第二个方面所述的基因。

7、本发明的第四个方面，提出一种菌株，包含有第三个方面所述的表达载体。

8、进一步地，所述菌株为大肠杆菌。

9、本发明的第五个方面，提出甾体c1,2脱氢酶突变体的生产方法，步骤包括：以第四个方面所述菌株进行培养，收集培养物得到甾体c1,2脱氢酶突变体。

10、本发明的第六个方面，提出第一个方面所述甾体c1,2脱氢酶突变体在制备甾体药物中间体中的应用，所述甾体药物中间体为醋酸环丙孕酮脱氢物，以17α-oh黄体酮或其衍生物为底物进行c1，c2位脱氢反应制备得到。

11、本发明的第七个方面，醋酸环丙孕酮脱氢物的制备方法，步骤包括：向17α-oh黄体酮或其衍生物溶液中加入乳化剂、电子受体及第一个方面所述的甾体c1,2脱氢酶突变体进行混合，反应得到醋酸环丙孕酮脱氢物。

12、进一步地，所述17α-oh黄体酮或其衍生物的结构式为式(1)、式(3)或式(5)之一，进行c1，c2位脱氢转化为醋酸环丙孕酮脱氢物过程如下：

13、

14、上述式(1)、式(3)、式(5)结构的17α-oh黄体酮或其衍生物经c1，c2位脱氢分别依次转化为式(2)、式(4)、式(6)结构的醋酸环丙孕酮脱氢物

15、进一步地，所述乳化剂为peg 200，peg 300，peg 400或曲拉通x-100中的至少一种；优选为peg 300。

16、进一步地，所述电子受体为吩嗪硫酸甲酯或甲萘醌中的至少一种，优选为甲萘醌。

17、进一步地，所述17α-oh黄体酮溶液为pbs溶液。

18、进一步地，所述反应过程ph为7.5-8.0。

19、进一步地，所述反应过程温度为35℃。

20、进一步地，所述17α-oh黄体酮的结构式为式(1)时，所述甾体c1,2脱氢酶突变体的氨基酸序列如seq id no：3所示；所述17α-oh黄体酮衍生物的结构式为式(3)或式(5)时，所述甾体c1,2脱氢酶突变体的氨基酸序列如seq id no：4所示。

21、与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：

22、本发明所述甾体c1,2脱氢酶突变体催化活性高，应用于酶催化制备醋酸环丙孕酮脱氢物具有反应体系简单温和，转化周期短，副反应少，成本低等优点，推广了酶催化制备醋酸环丙孕酮中间体的工业应用。

23、本发明醋酸环丙孕酮脱氢物制备过程基于甾体c1,2脱氢酶突变体的反应体系均为水相体系，避免了大量有机溶剂及有毒试剂的使用，安全绿色环保；且投料浓度能够达到50-100g/l，转化时间短(＜12h)，转化率高(＞95％)，副反应少等优点。

24、本发明提供的酶催化制备醋酸环丙孕酮脱氢物反应后处理工艺简单，所用溶剂均为常规溶剂，如甲醇，乙醇等，且均可回收套用，大大降低了生产成本。

1.氨基酸序列如seq id no：3、4所示的甾体c1,2脱氢酶突变体。

2.编码权利要求1所述甾体c1,2脱氢酶突变体的基因。

3.表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述的基因。

4.一种菌株，其特征在于，包含有权利要求3所述的表达载体。

5.根据权利要求4所述的菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌。

6.甾体c1,2脱氢酶突变体的生产方法，其特征在于，步骤包括：以权利要求4所述菌株进行培养，收集培养物得到甾体c1,2脱氢酶突变体。

7.权利要求1所述甾体c1,2脱氢酶突变体在制备甾体药物中间体中的应用，其特征在于，所述甾体药物中间体为醋酸环丙孕酮脱氢物，以17α-oh黄体酮或其衍生物为底物进行c1，c2位脱氢反应制备得到。

8.醋酸环丙孕酮脱氢物的制备方法，其特征在于，步骤包括：向17α-oh黄体酮或其衍生物溶液中加入乳化剂、电子受体及权利要求1所述的甾体c1,2脱氢酶突变体进行混合，反应得到醋酸环丙孕酮脱氢物。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述17α-oh黄体酮的结构式为式(1)，所述17α-oh黄体酮衍生物的结构式为(3)或式(5)：

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述乳化剂为peg 200，peg 300，peg400或曲拉通x-100中的至少一种；