一种基于环境DNA的候鸟群落监测方法及其应用与流程

本发明属于生物多样性监测，具体涉及一种基于环境dna的候鸟群落监测方法及其应用。

背景技术：

1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

2、我国是世界上鸟类资源最为丰富的国家之一，也是全球候鸟跨境迁徙的重要通道。全球九大候鸟迁飞通道中，有4条途经我国，几乎覆盖了我国全部领土和领海。科学监测生物多样性，获得完善的基础资料信息是区域生态环境及生物多样性保护的前提。传统鸟类生物多样性监测方法，大多采用“人工+观测设备”的方式，人力物力投入大，且对监测人员的要求较高：要具备一定的分类学基础、要有一定的拍摄技巧、还能够坚持长期野外工作。因此，传统监测方式难以保证鸟类监测的准确性、连续性、完整性。

3、环境dna(environmental dna,edna)技术，是通过从环境介质(水、土壤、沉积物等)中提取生物遗留的dna，对基因组的特定dna片段进行高通量测序，从而反映其生物多样性。edna技术作为非侵入性方法，时空敏锐度强，对生物群落干扰小，可克服传统方法的分类鉴定限制，是一种新兴的生物多样性监测技术。

4、然而，发明人发现，在实际候鸟监测过程中，edna技术仍面临许多挑战。鸟类活动区域多、范围广(水、土、气等)，导致环境中存在的dna含量极低。edna如何有效富集、消除杂质干扰是巨大挑战。同时，鸟类栖息地附近水体由于鸟类踩踏、生物扰动及鸟营养化问题，水体总体较浑浊，水中固体颗粒物影响滤膜的通过性、影响edna的富集。此外，edna中存在原核生物、无脊椎动物、浮游植物等诸多生物类群基因的干扰，因此如何有效富集鸟类dna及消除生物信息学分析过程中的假阳性问题也是目前亟待解决的问题。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明提供一种基于环境dna的候鸟群落监测方法及其应用。具体的，本发明通过多步骤优化候鸟群落监测方法，使得本发明的监测方法能实现较高的灵敏度与较低的错配率，同时有效节省人力物力和时间，操作简易高效。基于上述研究成果，从而完成本发明。

2、具体的，本发明涉及以下技术方案：

3、本发明的第一个方面，提供一种基于环境dna的候鸟群落监测方法，所述候鸟群落监测方法包括：

4、s1、水环境样品采集及前处理：在迁徙候鸟栖息地附近的水域中沿岸边设置样线；在样线上连续采集表层水样，过滤后加入乙醇/乙酸钠溶液，低温环境保存；

5、s2、空气样品采集及前处理：在迁徙候鸟觅食地下风口的陆地上设置样点，收集空气颗粒并经清洗过滤后，置于低温环境中保存；

6、s3、将步骤s1和s2收集并经前处理后的样品进行edna基因扩增、高通量测序及分析；

7、s4、生物信息分析：高通量测序得到的基因序列，通过质控处理后得到高质量片段序列；经序列比对后判定序列的分类单位，仅保留鸟纲(aves)中科及以下分类水平(属和种)的序列。

8、需要说明的是，本发明中，步骤s1和s2并未先后顺序之分。

9、本发明的第二个方面，提供上述方法在鸟类生物多样性监测中的应用。

10、以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

11、上述技术方案在候鸟栖息地附近水体中沿岸边连续采集水样，解决了定位样点采集导致的代表性不足的问题；水样先通过大孔径的滤膜，以排除较大颗粒杂质，降低其对edna提取的影响。此外，收集候鸟觅食地周边的空气颗粒，清洗杂质再分离释放edna。水体及空气edna的全面收集以最大限度收集候鸟的edna。此外，在edna生物信息分析中，去除错配序列、低质量序列及极小频次出现序列，以保证结果的有效性。通过上述各步骤协同配合，使上述技术方案的监测方法能实现较高的灵敏度与较低的错配率。

12、同时，上述监测方法还具有高灵敏度、高通量的优势，可以全面、系统地监测该区域候鸟多样性，特别是难以肉眼捕捉的鸟类，且无需采集目标鸟类、无需肉眼或相机捕获，对生境干扰小、对鸟类群落无破坏；操作简易高效，节约了调查作业和鸟类物种鉴定所需的时间，因此具有良好的实际应用价值。

1.一种基于环境dna的候鸟群落监测方法，其特征在于，所述候鸟群落监测方法包括：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s1中，样线设置条数为2-4条，每条样线长度不低于500米；

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s1中，所述过滤采用滤膜过滤方式，优选为依次使用5μm以及0.45μm孔径的滤膜进行过滤。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s1中，所述乙醇/乙酸钠溶液为将无水乙醇和乙酸钠溶液按照体积比20:0.5-2混合获得，所述乙酸钠溶液中乙酸钠的浓度为1-5mol/l。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s2中，所述清洗过滤中，所述清洗采用清洗液进行，具体的，将空气颗粒与清洗液混匀，振荡处理后，再向其中添加复合维生素、蛋白酶k、pbs缓冲液以及sds，继续振荡处理，离心，收集上清液滤膜过滤，收集滤膜上的dna；进一步的，所述清洗液为含有0.1-0.2mm的乙二胺四乙酸二钠、1％-1.5％的聚乙二醇辛基苯基醚的75％乙醇溶液；所述空气颗粒按质量体积比0.5-2:10-20与清洗液混匀，35-40℃水浴振荡2-3h。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s2中，所述收集空气颗粒具体为在同一采样点连续3-5天、每天选择日出后和日落前0-3小时时间进行收集。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s2中，所述空气颗粒与所述复合维生素、蛋白酶k、pbs缓冲液、sds的质量比为30-50:1-5:0.5-2:300-500:10-30；所述复合维生素中含有质量比为8-12:6-10:15-25:20-30:1-5:20-30:5-15的生物素、叶酸、盐酸硫胺素、核黄素、维生素b12、对氨基苯甲酸和烟酰胺。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s3中，扩增选用引物的核苷酸序列如seq id no.1-4所示。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤s4的具体方法包括：高通量测序得到的基因序列，去除序列长度小于50bp且质量评分低于20的低质量碱基及不确定碱基，去除计数低于10的低频序列，通过以上质控处理后得到高质量片段序列，将获得序列与ncbi数据库对比，判定序列的分类单位。

10.权利要求1-9任一项所述方法在鸟类生物多样性监测中的应用。