MsDUF3700蛋白及其编码基因在调控植物耐逆性、生长发育与产量中的应用

本发明涉及生物，具体涉及msduf3700蛋白及其编码基因在调控植物耐逆性、生长发育与产量中的应用。

背景技术：

1、铝（al）毒是降低酸性土壤上作物产量的主要因素。毒性的主要症状是抑制根生长，al3+可破坏许多其他功能，包括根毛伸长、营养吸收，诱导氧化应激，破坏细胞骨架，并影响细胞内运输抑制根系的生长和功能，这种毒性又导致了干旱和矿物质元素缺乏导致的作物产量下降。

2、紫花苜蓿（ medicago sativa）是全球栽培面积最大的多年生豆科牧草，因其营养丰富、蛋白质含量高且适应性强等特性，广泛应用于畜牧业。为了满足日益增长的苜蓿需求，除了提高苜蓿产量还需利用原来认为不适宜种植苜蓿的酸性土地。我国南方大面积的红壤地区由于土壤具有强酸、高活性铝的特性，导致紫花苜蓿生长缓慢、产量低，难以发展规模化种植，严重制约了南方草地畜牧业的发展。因此，开展紫花苜蓿铝毒研究在理论和应用方面均有重要意义。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是如何调控植物耐逆性、生长发育与产量。

2、为了解决上述技术问题，本发明首先提供了msduf3700蛋白的新用途。

3、本发明提供了msduf3700蛋白在如下1）-5）任一种中的应用：

4、1）调控植物耐逆性；

5、2）调控植物生长发育；

6、3）调控植物产量；

7、4）培育株高和/或茎粗和/或产量和/或耐逆性提高的转基因植物；

8、5）植物育种；

9、所述msduf3700蛋白为如下a1）或a2）或a3）或a4）：

10、a1）氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；

11、a2）在序列3所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白质；

12、a3）将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物耐逆性和/或生长发育和/或产量相关的蛋白质；

13、a4）与序列3所示的氨基酸序列具有80%同一性、来源于苜蓿且与植物耐逆性和/或生长发育和/或产量相关的蛋白质。

14、上述a2）所述蛋白质中，所述标签是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签包括但不限于：gst（谷胱甘肽巯基转移酶）标签蛋白、his6标签蛋白（his-tag）、mbp（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白、flag标签蛋白、sumo标签蛋白、ha标签蛋白、myc标签蛋白、gfp（绿色荧光蛋白）、cfp（青色荧光蛋白）、yfp（黄绿色荧光蛋白）、mcherry（单体红色荧光蛋白）或avitag标签蛋白。

15、上述a3）所述蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过9个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过8个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过7个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过6个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过4个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过3个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过2个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过1个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

16、上述a4）所述蛋白质中，所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同一性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambdaratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（%）。所述同一性包括与本发明的序列3所示的氨基酸序列具有80%或更高，或具有85%或更高，或具有90%或更高，或91%或更高，或92%或更高，或93%或更高，或94%或更高，或95%或更高，或96%或更高，或97%或更高，或98%或更高，或99%或更高同一性的氨基酸序列。

17、上述a1）-a4）所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

18、为了解决上述技术问题，本发明还提供了与上述msduf3700蛋白相关的生物材料的新用途。

19、本发明提供了与上述msduf3700蛋白相关的生物材料在如下1）-5）中任一种中的应用：

20、1）调控植物耐逆性；

21、2）调控植物生长发育；

22、3）调控植物产量；

23、4）培育株高和/或茎粗和/或产量和/或耐逆性提高的转基因植物；

24、5）植物育种；

25、所述生物材料为下述a1）至a8）中的任一种：

26、a1）编码msduf3700蛋白的核酸分子；

27、a2）含有a1）所述核酸分子的表达盒；

28、a3）含有a1）所述核酸分子的重组载体；

29、a4）含有a2）所述表达盒的重组载体；

30、a5）含有a1）所述核酸分子的重组微生物；

31、a6）含有a2）所述表达盒的重组微生物；

32、a7）含有a3）所述重组载体的重组微生物；

33、a8）含有a4）所述重组载体的重组微生物。

34、上述应用中，a1）所述核酸分子为如下b1）或b2）所示的基因：

35、b1）序列1或序列2所示的dna分子；

36、b2）与b1）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码msduf3700蛋白的dna分子。

37、其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。

38、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码msduf3700蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码msduf3700蛋白的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要编码msduf3700蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

39、这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

40、上述75%或75%以上同一性，可为80%、85%、90%或95%以上的同一性。

41、上述应用中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达msduf3700蛋白的dna，该dna不但可包括启动 msduf3700转录的启动子，还可包括终止 msduf3700转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子（nos终止子）、花椰菜花叶病毒camv 35s终止子、tml终止子、豌豆rbcse9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。

42、上述应用中，所述载体是指能够把上述核酸分子运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体，包括但不限于：质粒、噬菌体（如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等）、黏粒（即柯斯质粒）、ti质粒、病毒载体（如逆转录病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒等）。

43、所述重组载体是指将上述核酸分子与所述载体在体外连接构建而成的重组dna分子。可用现有的植物表达载体构建含有所述 msduf3700基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pahc25、pbin438、pcambia1302、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3´端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3´端，如农杆菌冠瘿瘤诱导（ti）质粒基因（如胭脂碱合成酶基因 nos）、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3´端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（ gus基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的 nptii基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的 bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的 hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的 dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的epsps基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

44、上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。所述细菌具体可为农杆菌，如农杆菌eha105。

45、所述重组微生物是指对目的微生物的基因进行操作和修饰，从而得到功能发生变化的重组微生物。如将上述重组载体导入目的微生物后得到的重组微生物。所述重组微生物可理解为不仅是指特定的重组微生物，而且也指这种细胞的后代，且由于天然的、偶然的或有意的突变和/或改变，该子代可以不必与原始的亲代细胞完全一致，但仍包括在重组微生物的范围中。

46、上述应用中，所述调控植物耐逆性为提高植物耐逆性，即当植物中msduf3700蛋白的含量和/或活性提高时，植物的耐逆性提高。

47、进一步的，所述提高植物耐逆性为提高植物铝耐受性。

48、更进一步的，所述提高植物铝耐受性为提高植物地上部分铝耐受性。

49、在本发明的一个具体实施方案中，所述调控植物耐逆性体现为：当植物中的 msduf3700基因表达量提高时，在铝胁迫条件下，植物的相对茎伸长增加、地上部分鲜重增加、茎铝含量降低。

50、上述应用中，所述调控植物生长发育为促进植物生长发育，即当植物中msduf3700蛋白的含量和/或活性提高时，植物的生长发育更优。

51、进一步的，所述促进植物生长发育为增加植物株高和/或茎粗。

52、在本发明的一个具体实施方案中，所述调控植物生长发育体现为：当植物中的 msduf3700基因表达量提高时，植物的株高增加、茎粗增加。

53、上述应用中，所述调控植物产量为提高植物产量，即当植物中msduf3700蛋白的含量和/或活性提高时，植物的产量增加。

54、进一步的，所述提高植物产量为提高植物地上部分鲜重。

55、在本发明的一个具体实施方案中，所述调控植物产量体现为：当植物中的 msduf3700基因表达量提高时，植物的地上部分鲜重增加。

56、上述应用中，所述植物育种的目的为培育耐铝和/或高产植物品种。

57、为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育株高和/或茎粗和/或产量和/或耐逆性提高的转基因植物的方法。

58、本发明提供的培育株高和/或茎粗和/或产量和/或耐逆性提高的转基因植物的方法包括如下步骤：提高受体植物中上述msduf3700蛋白的含量和/或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的株高和/或茎粗和/或产量和/或耐逆性高于所述受体植物。

59、上述方法中，所述耐逆性为铝耐受性。

60、进一步的，所述铝耐受性为地上部分铝耐受性。

61、再进一步的，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物体现为如下m1）-m3）中任一种：

62、m1）在铝胁迫条件下，所述转基因植物的相对茎伸长高于所述受体植物；

63、m2）在铝胁迫条件下，所述转基因植物的地上部分鲜重高于所述受体植物；

64、m3）在铝胁迫条件下，所述转基因植物的茎铝含量低于所述受体植物。

65、更进一步的，所述铝胁迫为alcl3胁迫。

66、在本发明的具体实施方案中，所述alcl3胁迫为200µm alcl3。

67、上述方法中，所述提高受体植物中上述msduf3700蛋白的含量和/或活性的方法为在受体植物中过表达上述msduf3700蛋白。

68、进一步的，所述过表达的方法为将msduf3700蛋白的编码基因导入受体植物中。

69、更进一步的，所述msduf3700蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列2所示。

70、上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述 msduf3700基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

71、上述任一所述应用或方法中，所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述双子叶植物具体可为豆科植物；所述豆科植物可为苜蓿属植物；所述苜蓿属植物可为苜蓿；所述苜蓿可为紫花苜蓿（如紫花苜蓿中苜一号）。

72、本发明的有益效果在于：本发明首次将 msduf3700基因在紫花苜蓿中过表达，获得过表达 msduf3700的转基因紫花苜蓿，并通过对过表达 msduf3700的转基因紫花苜蓿的耐逆性、生长发育与产量性状进行研究发现： msduf3700基因对铝胁迫以及植物的生长发育（如株高和茎粗）与产量（地上部分鲜重）具有调控功能。本发明填补了未知功能基因在苜蓿中无相关报道的空白，为苜蓿耐逆性与高品质兼具的新品种的选育提供了理论基础和新方法。