微生物细胞中红光调控系统及其制备方法、应用

本发明涉及基因改造，特别涉及微生物细胞中红光调控系统及其制备方法、应用。

背景技术：

1、利用微生物细胞工厂绿色、高效、低成本的生产化合物已成为极具潜力的可持续性替代方法。与化学合成法和生物提取法相比，微生物发酵法的环境压力小、发酵周期短，具有十分广阔的应用前景。

2、本领域通常对微生物的代谢路径进行优化来提高目标产物产量，优化的策略包括静态调控和动态调控。静态调控策略包括基因的插入和敲除、调节启动子强度和核糖体结合位点等方式来增加底物向目标化合物的转化率，从而提高目标产物产量。然而，静态调控需要通过改变细胞内的代谢通路或引入外源基因来达到提高产量的目的，打破了目标产物的生产与细胞生长之间的平衡，最终导致产品不能大规模生产。因此，静态调控系统往往会使基因的表达水平在不感知代谢通路和细胞环境变化的情况下一直输出，造成细胞生长阻滞。相反，动态调控系统可以通过感知环境和细胞内信号来实时调节细胞的代谢状态，它可以使细胞生长良好，始终保持细胞在生产阶段处于最佳状态，从而有效提高目标产品的产量。

技术实现思路

1、为弥补现有技术空白，本发明提供了光控元件、红光动态调控系统及该红光动态调控系统的应用。

2、本发明的发明构思是：本发明构建了红光动态调控系统，具有低毒性和人工控制合成途径等优点。模式微生物酿酒酵母作为底盘菌株，具有清晰的遗传背景易于进行基因改造、生长周期短、培养成本低等特性。将光控系统引入到酿酒酵母中进行基因表达的调控，不仅能够从时空上精确调控基因的表达，而且还能够有效地使细胞的生长和生产阶段解离，有效提高菌株的生产性能。光敏蛋白作为光调控系统的核心元件，本发明发明人在众多的光敏蛋白中发现，受红光调控的植物光敏色素phya具有对细胞的毒性小、组织穿透性强、光激活应答速度快等特点，同时，phya与fhy1的作用效果比phyb/pif3更强。更有利于调控菌体生长与代谢产物积累的平衡。

3、本发明的首要目的在于，提供光控元件，所述光控元件ⅰphya(1-1126aa)的引物序列如seq id no:1～2所示。

4、所述光控元件ⅱphya突变体(1-412aa)的引物序列如seq id no:3～4所示。

5、所述光控元件ⅲphya(1-591aa)的引物序列如seq id no:5～6所示。

6、所述光控元件ⅳfhy1(1-202aa)的引物序列如seq id no:7～8所示。

7、所述光控元件ⅴfhy1(167-202aa)的引物序列如seq id no:9～10所示。

8、本发明gal4bd的引物序列如seq id no:11～12所示。

9、本发明vp64的引物序列如seq id no:13～14所示。

10、本发明同时请求保护由上述光控元件构建的光控系统。

11、所述光控系统由phya(1-1126aa)、phya(1-412aa)、phya(1-591aa)中任一种与gal4bd基因重组得到的线性化载体，插入fhy1(1-202aa)、fhy1(167-202aa)中任一种与vp64基因重组所得载体，即得光控系统。

12、作为本发明优选的实施例，光控系统的构建方法为：

13、将pyes2-kan表达载体用bamh i酶切，载体酶切后与光控元件ⅰ～ⅲ任一种和gal4bd基因重组连接后，在平板上挑取单克隆进行菌落pcr鉴定，上述光控元件对应的引物phya(1-1126aa)-f或phya(1-591aa)-f或phya(1-412aa)-f之一与引物gal4bd-r扩增目的片段；将菌液扩培提取重组质粒后，验证目的基因是否插入pyes2-kan载体中，使用bamh i进行酶切验证。

14、将上述表达载体用sac i酶切，得到线性化载体，该线性化载体与光控元件ⅳ或ⅴ与人工合成vp64基因重组连接后，在平板上挑取单克隆进行菌落pcr鉴定，以fhy1(1-202aa)-f或fhy1(167-202aa)-f之一和基因vp64-r为引物扩增目的片段；将菌液扩培提取重组质粒后，验证目的基因是否插入载体，使用sac i进行酶切验证。

15、本发明同时请求保护上述光控系统在产萜类化合物上的应用，所述萜类化合物包括不限于β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、番茄红素、玉米黄质、叶黄素。

16、β-胡萝卜素属于四萜类化合物，具有很高的营养价值。β-胡萝卜素是通过化学合成或从植物中提取来生产的。化学合成法生产的β-胡萝卜素是利用有机化工原材料经过一系列化学反应而合成。植物体中类胡萝卜素与蛋白质一般以结合的状态存在，采用传统的直接浸提法，浓缩后得到β-胡萝卜素色素粗制品中含有一定的醇溶蛋白，不利于纯化且对环境造成污染，并且由于植物生长周期长，生长易受光照、地域、季节等自然因素影响，植物提取法还存在着植物中玉米黄质含量低，提取成本高，生产过程控制困难等缺点。

17、然而，植物提取法和化学合成法合成β-胡萝卜素都存在一些问题和不足，日益增长的需求需要开发替代来源，所以目前在微生物中异源合成β-胡萝卜素是极具潜力的生产方法。本发明利用转接光控系统微生物发酵为生产β-胡萝卜素提供了一条替代和可持续的途径，提供了额外的优势，如高产品产量、低材料成本和低环境影响。

18、一种构建产萜类化合物的酿酒酵母菌株发酵方法，包括如下步骤：

19、挑取正确的阳性单克隆菌株于sd-met-ura培养基中，培养制备发酵种子液，将种子液以5％的接种量移至100ml ypd培养基中，28℃，180rpm培养2-3天。

20、转接含有光控诱导的质粒的酿酒酵母并进行红光响应性能测试，培养基为sd-met-ura3，装液量为25/100(即，100ml锥形瓶中装有25ml的sd-met-ura3培养基)。在装有红光灯(600-700nm)的恒温摇床(28℃，180-200r/min)中培养72-120h，其中每隔1-6h光照，1-6h停止光照。取样测定rfu与od600值，评价诱导效果，每组设置三个重复。培养测试时按接种量1-5％的条件接种培养。

21、本发明同时请求保护上述光控系统在产甾体化合物上的应用，如维生素d3前体7-dhc。

22、维生素d是维持机体健康及正常生长所必需的一种脂溶性维生素，在日用化工、医药及食品领域都有着重要的应用价值。维生素d主要有两种形式，即维生素d2和维生素d3，但研究表明维生素d3能够转化成1,25-(oh)2d3，以更有效的形式发挥生理活性。维生素d3的市场需求量在逐年上升。工业化生产维生素d3的主要方法为化学合成法，其产品纯度低、副产物多；生物提取法也可以制备维生素d3，但是存在提取效率低、成本高及生产不稳定等问题，难以实现工业化生产。目前，微生物发酵法生产维生素d3主要是通过在微生物体内构建代谢合成途径，以简单碳源为底物，生物合成维生素d3的重要前体7-脱氢胆固醇(7-dhc)，进一步通过光异构化获取维生素d3。酿酒酵母因具有生长周期短，易于遗传操作，自身含有甾醇生物合成模块等优势，已被优先作为底盘细胞用于7-dhc的合成。

23、一种构建产甾体化合物的酿酒酵母菌株发酵方法，包括如下步骤：

24、挑取正确的阳性单克隆菌株于sd-met-ura培养基中，培养制备发酵种子液，将种子液以5％的接种量移至100ml ypd培养基中，30℃，200rpm培养2-3天。

25、转接含有光控诱导的质粒的酿酒酵母并进行红光响应性能测试，培养基为sd-met-ura3，装液量为25/100(即，100ml锥形瓶中装有25ml的sd-met-ura3培养基)。在装有红光灯(600-700nm)的恒温摇床(30℃，180-200r/min)中培养48-120h，其中每隔1-12h光照，1-12h停止光照。取样测定rfu与od600值，评价诱导效果，每组设置三个重复。培养测试时按接种量2-4％的条件接种培养。

26、与现有技术相比，本发明具有以下优势：

27、1.本发明获得红光调控元件，并构建红光调控基因表达的酵母系统，该系统通过红光动态调控菌体生长与代谢产物积累的平衡，缓解产物积累过多抑制细胞生长的问题。

28、2.采用本发明的动态调控系统诱导合成7-dhc的产量得到显著提高，较常规方法产量提高25倍。

29、3.采用本发明的动态调控系统诱导合成类胡萝卜素产量得到显著提高，较常规方法产量提高20倍。

30、4.本发明采用红光诱导方法简易，无需添加任何有机或毒害试剂。

31、5.本发明光控系统采用红光穿透力更高，减少其他光源对细胞的毒害和干扰作用。