2-辛基-3-异噻唑啉酮在防治烟草真菌病害中的应用及鉴定方法与流程

本发明涉及2-辛基-3-异噻唑啉酮在防治烟草真菌病害中的应用及鉴定方法，属于真菌病害防治。

背景技术：

1、烟草是我国重要的经济作物，然而，烟草属于叶用经济作物，在其生长过程中容易受各种病虫危害，其中烟草黑胫病和赤星病危害十分严重。目前生产上对上述两种病害的防治主要以化学农药防治为主，甲霜灵锰锌、烯酰吗啉、霜霉威、菌核净等主用药剂使用年限长，由于药剂品种相对单一，药剂抗药性问题日益突出，亟需开发新的替代药剂。

技术实现思路

1、本发明提供一种从枯草芽孢杆菌和棘孢木霉共培养代谢物中鉴定的新型抑菌物质2-辛基-3-异噻唑啉酮，该化合物对烟草黑胫病菌和赤星病菌具有强抑制活性，可用于烟草黑胫病和赤星病的绿色防控，可以克服现有技术的不足。

2、本发明的技术方案：

3、2-辛基-3-异噻唑啉酮作为抑菌物质的应用。

4、2-辛基-3-异噻唑啉酮作为防治烟草黑胫病的应用。

5、2-辛基-3-异噻唑啉酮作为防治烟草赤星病的应用。

6、所述2-辛基-3-异噻唑啉酮的分子式为c11h19nos，结构式如i所示：

7、

8、i

9、前述的2-辛基-3-异噻唑啉酮是，所述的2-辛基-3-异噻唑啉酮是从枯草芽孢杆菌和棘孢木霉共培养代谢物中鉴定所得。

10、前述的2-辛基-3-异噻唑啉酮是，从枯草芽孢杆菌和棘孢木霉共培养代谢物中鉴定所得步骤为：

11、(1)将棘孢木霉hg1在pda培养基中28℃恒温培养5d，无菌水洗涤孢子，将20μl孢子悬浮液滴入细胞计数板中用全自动细胞计数仪计算孢子数目，无菌水调节孢子悬浮液的浓度为1×105cfu/ml，获得棘孢木霉hg1孢子悬浮液；

12、将枯草芽孢杆菌tpb55在na培养基中培养24h，接种于lb培养基中，在28℃、180rpm下培养24h，将200μl菌液置于微孔板中并通过酶标仪读取od600值，用无菌水将菌液浓度稀释至1×106cfu/ml，获得tpb55菌悬液；

13、(2)将5ml棘孢木霉hg1孢子悬浮液单独接种于250ml lb培养基中，在28℃、180rpm下发酵7d，得到单培养发酵液h；将500μl枯草芽孢杆菌tpb55菌悬液单独接种于250ml lb培养基中，在28℃、180rpm下发酵6d，得到单培养发酵液t；将5ml棘孢木霉hg1和500μl枯草芽孢杆菌tpb55顺序接种于lb肉汤中，接种时间间隔24h，在28℃、180rpm下共培养7d，得到共培养发酵液ht；

14、(3)将h、t和ht发酵液各50ml，6000rpm离心5min，pbs缓冲液洗涤，离心3次清除培养基，获得菌丝提取物，液氮速冻后-80℃保存；取各样品100mg于1.5ml微量离心管中，加入500μl浓度为80％的甲醇水溶液，涡旋振荡后冰浴5min，在4℃，15000rpm的条件下离心20min，收集上清液用于lc-ms分析；lc-ms/ms在正离子模式和负离子模式下使用以下洗脱系统，正离子模式，流动相0.1％甲酸和流动相甲醇；负离子模式，流动相5mm乙酸铵，ph 9.0和流动相甲醇；柱温设置为40℃，流速为0.2ml/min；洗脱梯度设置如下：0min，12％ b；1.5min，2％ b；12min，100％ b；14min，100％ b；14.1min，2％b；17min，2％b；

15、(4)原始数据通过compound discoverer 3.1筛选保留时间、荷质比等参数，然后对每一种代谢物进行前对齐、峰提取和峰面积定量；此后将获得的信息与mzcloud、mzvault和masslist三种数据库进行比对，最终得到代谢物的鉴定与相对定量的结果；使用统计软件r version r-3.4.3，python 2.7.6version和centos release 6.6进行统计分析；偏最小二乘判别分析pls-da由代谢组学数据处理软件metax进行；基于单变量分析t检验计算组间代谢物的统计学显着性p-value和差异倍数变化，差异代谢物的筛选标准为vip>1.0、fc>1.5或fc<0.667和p-value<0.05；

16、代谢组学分析表明，棘孢木霉hg1与枯草芽孢杆菌tpb55共培养能够促进具有抗菌活性的次级代谢物生成，次级代谢物包括2-辛基-3-异噻唑啉酮。

17、与现有技术比较，本发明通过枯草芽孢杆菌和棘孢木霉共培养代谢物中鉴定的新型抑菌物质2-辛基-3-异噻唑啉酮，通过将2-辛基-3-异噻唑啉酮用于烟草盆栽试验，试验表明2-辛基-3-异噻唑啉酮对烟草黑胫病和赤星病具有优异的防病效果，其中以100μg/ml、200μg/ml的2-辛基-3-异噻唑啉酮稀释液灌根处理防治烟草黑胫病效果分别为92.38％和100％；100μg/ml和200μg/ml 2-辛基-3-异噻唑啉酮对烟草叶面喷雾防治赤星病的效果分别为80.80％和84.33％。

1.2-辛基-3-异噻唑啉酮作为抑菌物质的应用。

2.2-辛基-3-异噻唑啉酮作为防治烟草黑胫病的应用。

3.2-辛基-3-异噻唑啉酮作为防治烟草赤星病的应用。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的2-辛基-3-异噻唑啉酮的分子式为c11h19nos，结构式如i所示：

5.根据权利要求3所述的2-辛基-3-异噻唑啉酮，其特征在于：所述的2-辛基-3-异噻唑啉酮是从枯草芽孢杆菌和棘孢木霉共培养代谢物中鉴定所得。

6.根据权利要求4所述的2-辛基-3-异噻唑啉酮，其特征在于，从枯草芽孢杆菌和棘孢木霉共培养代谢物中鉴定所得步骤为：