一种用于自动细胞收获仪的羊水染色体核型胰酶收获法的制作方法

本发明涉及细胞培养，更具体地，涉及一种用于自动细胞收获仪的羊水染色体核型胰酶收获法。

背景技术：

1、羊水细胞培养及核型分析是产前诊断的关键技术，该技术需要历经羊水细胞贴壁、收获(低渗、预固定、固定)、制片(染色体分散)、显微镜下拍取核型及核型分析等诸多步骤，以完成最终的临床报告。

2、羊水染色体核型收获原理：细胞中心粒的微管会在分裂中期与染色体的动粒相连，而微管是由a亚单位和beta亚单位组成的管状结构，而秋水仙素作用于a和beta亚单位之间，让其微管的结构不稳定，不能牵拉染色体，从而使细胞的核分裂无法完成，停留在分裂中期，得到染色体核型。

3、目前的羊水染色体核型在收获羊水细胞后得到核型的总数较少，带型多、分散好的优质染色体核型数量更少，导致优质核型提取困难、核型分析困难，容易产生检测失败及误差，因此急需对此进行改进。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种用于自动细胞收获仪的羊水染色体核型胰酶收获法，通过加入低浓度的秋水仙素和5-溴脱氧尿嘧啶核苷，从而能够在自动细胞收获仪内实现染色体核型的收获，并能够得到大量优质核型，从而便于核型提取和核型分析。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种用于自动细胞收获仪的羊水染色体核型胰酶收获法，包括以下步骤：

4、s1、在培养瓶中加入培养液和羊水细胞，培养7～8天；

5、s2、当羊水细胞培养物在瓶底贴壁长出细胞克隆后，加入低浓度的秋水仙素及5-溴脱氧尿嘧啶核苷，进行细胞同步化处理；

6、s3、倒出上清，加入胰蛋白酶，进行消化；

7、s4、吹打培养瓶瓶底的羊水细胞培养物，将培养物吸出到离心管中，并加入步骤s3中倒出的上清液到离心管中混匀，对胰酶作用进行中止；

8、s5、将离心管放入自动细胞收获仪中进行处理；

9、s6、将离心管中的羊水细胞悬液取出，并将羊水细胞悬液在恒温洹湿的滴片仪中进行滴片，使羊水细胞瞬时破裂，染色体分散铺展在载玻片上，形成二维的染色体核型平面结构；

10、s7、将滴有染色体核型的载玻片置于烤片机下烤片，取出载玻片后，胰酶浸泡处理，盐水漂洗，吉姆萨染液浸泡处理；

11、s8、采用显微镜拍取细胞载玻片，自动核型扫描仪捕获采集染色体核型。

12、进一步的，在步骤s2中，加入的秋水仙素浓度为5ug/ml～7ug/ml，加入量为20ul～40ul，使培养液中的秋水仙素终浓度为0.06ug/ml～0.10ug/ml。

13、进一步的，所述秋水仙素浓度为6ug/ml，加入量为30ul。

14、进一步的，5-溴脱氧尿嘧啶核苷浓度是1mg/ml，加入量为20ul～40ul，使培养液中的5-溴脱氧尿嘧啶核苷终浓度为6.7ug/ml～13ug/ml，细胞同步化处理时间为17h～19h之间。

15、进一步的，5-溴脱氧尿嘧啶核苷加入量为30ul，细胞同步化处理时间为18h。

16、进一步的，在步骤s3中加入0.5g/l胰蛋白酶4ml，并消化7min。

17、进一步的，步骤s5中具体步骤为：

18、①、平衡离心；

19、②、弃上清，加入低渗液6ml，充分混匀；

20、③、孵育10min，使羊水细胞肿胀；

21、④、在离心管内加0.5ml固定液，混匀，使羊水细胞保持肿胀状态；

22、⑤、平衡离心；

23、⑥、弃上清，在离心管中加入6ml固定液；

24、⑦、重复步骤⑤至步骤⑥三次；

25、进一步的，低渗液为氯化钾溶液，浓度为0.075mol/l，固定液为卡诺固定液。

26、进一步的，平衡离心操作时间为10min，离心转速为1000rpm。

27、进一步的，在步骤s7中，所述载玻片在烤片机100℃下烤片1.5h，取出载玻片后在1mg/ml胰酶浸泡处理16～20s，盐水漂洗，吉姆萨染液浸泡处理3min。

28、本发明的有益效果是：

29、1、本发明中，通过在羊水细胞培养物中加入低浓度的秋水仙素和5-溴脱氧尿嘧啶核苷，从而能够在自动细胞收获仪内实现染色体核型的收获，并能够得到大量优质核型，便于核型提取和核型分析，使得羊水细胞染色体核型的收获可以进行自动化转化，大大减轻工作人员的压力，节约工作时间，并保证试验质量；

30、2、本发明首先采用特定低浓度的秋水仙素，在特定时间下培育羊水细胞，会产生大量的圆细胞，这些圆细胞是染色体停在分裂中期的细胞，秋水仙素也可以使细胞内微管进一步松解，细胞结构更加松散，在滴片的时候，染色体间铺展更顺利，减少互相缠绕，而圆细胞数量越多，能够产生的核型数量也越多，因此能够得到大量核型。而低浓度的5-溴脱氧尿嘧啶核苷(brdu)并能够使延缓细胞生长，在众多核型中挑选出足够数量的400～550条带的优质长核型。

1.一种用于自动细胞收获仪的羊水染色体核型胰酶收获法，其特征在于：包括以下步骤：

2.如权利要求1所述一种用于自动细胞收获仪的羊水染色体核型胰酶收获法，其特征在于：在步骤s2中，加入的秋水仙素浓度为5ug/ml～7ug/ml，加入量为20ul～40ul，使培养液中的秋水仙素终浓度为0.06ug/ml～0.10ug/ml。

3.如权利要求2所述一种用于自动细胞收获仪的羊水染色体核型胰酶收获法，其特征在于：所述秋水仙素浓度为6ug/ml，加入量为30ul。

4.如权利要求3所述一种用于自动细胞收获仪的羊水染色体核型胰酶收获法，其特征在于：5-溴脱氧尿嘧啶核苷浓度是1mg/ml，加入量为20ul～40ul，使培养液中的5-溴脱氧尿嘧啶核苷终浓度为6.7ug/ml～13ug/ml，细胞同步化处理时间为17h～19h之间。

5.如权利要求4所述一种用于自动细胞收获仪的羊水染色体核型胰酶收获法，其特征在于：5-溴脱氧尿嘧啶核苷加入量为30ul，细胞同步化处理时间为18h。

6.如权利要求1所述一种用于自动细胞收获仪的羊水染色体核型胰酶收获法，其特征在于：在步骤s3中加入0.5g/l胰蛋白酶4ml，并消化7min。

7.如权利要求1所述一种用于自动细胞收获仪的羊水染色体核型胰酶收获法，其特征在于：步骤s5中具体步骤为：

8.如权利要求7所述一种用于自动细胞收获仪的羊水染色体核型胰酶收获法，其特征在于：低渗液为氯化钾溶液，浓度为0.075mol/l，固定液为卡诺固定液。

9.如权利要求7所述一种用于自动细胞收获仪的羊水染色体核型胰酶收获法，其特征在于：平衡离心操作时间为10min，离心转速为1000rpm。

10.如权利要求1所述一种用于自动细胞收获仪的羊水染色体核型胰酶收获法，其特征在于：在步骤s7中，所述载玻片在烤片机100℃下烤片1.5h，取出载玻片后在1mg/ml胰酶浸泡处理16s～20s，盐水漂洗，吉姆萨染液浸泡处理3min。