基于一体化衍生与固相萃取的连续反应平台的神经递质检测方法与流程

本发明属于生物标记物检测，涉及一种基于一体化衍生与固相萃取连续反应平台的神经递质检测方法，尤其涉及一种基于一体化衍生与固相萃取的连续反应平台的高灵敏度的同时检测褪黑素、血清素、组胺和多巴胺的方法。

背景技术：

1、褪黑素(melatonin)、血清素(serotonin)、组胺(histamine)、多巴胺(dopamine)是神经体系里非常重要的化合物。这些化合物在神经系统中发挥着关键作用，各自调控不同的生理和心理过程。褪黑素(melatonin)：由松果体分泌，主要调节睡眠-觉醒周期和生物节律。褪黑素水平的异常与失眠、抑郁症和季节性情感障碍等相关。血清素(serotonin)：在大脑和肠道中均有分布，参与调节情绪、食欲、睡眠和记忆。血清素不足与抑郁症、焦虑症和其他情绪障碍有关。组胺(histamine)：在中枢神经系统中作为神经递质，调节觉醒、食欲和免疫反应。组胺还参与过敏反应和炎症反应。多巴胺(dopamine)：调控运动、奖励机制、动机和愉悦感。多巴胺的不足与帕金森病和抑郁症有关，过多则与精神分裂症和药物依赖相关。

2、同时检测褪黑素、血清素、组胺、多巴胺可以提供全面的神经化学状态信息，有助于：1)综合诊断：通过综合分析多个神经递质水平，帮助诊断神经系统疾病，如抑郁症、焦虑症、帕金森病等。2)精准治疗：监测多个神经递质的变化，优化药物治疗方案，提高治疗效果。3)生物标志物发现：多参数检测可以发现新的生物标志物，用于早期诊断和预后评估。

3、同时检测这些神经递质面临多个技术挑战：1)褪黑素和血清素、组胺、多巴胺在核心官能团上的差别比较大，褪黑素没有活性的伯氨基或者羟基，褪黑素结构式的氨基和羟基都被取代了，造成只有仲胺基团，仲胺基团化学性质稳定，室温下除非有很激烈的条件否则不能快速的发生衍生化反应，而血清素、组胺、多巴胺全都有活性的伯胺基团、羟基基团和羧基基团，这几类化学基团很容易在室温下快速发生衍生化反应；2)褪黑素、血清素、组胺、多巴胺这些化合物在体内的含量都很低，对检测灵敏度的要求很高，以褪黑素为例，健康人在白天褪黑素的最低浓度达到了2pg/ml，因此检测技术必须要能够测定到2pg/ml以下的浓度才能满足临床检测的要求，否则就会出现大量的人群血浆中褪黑素不能检出的情况，健康人都不能检出，特殊的病人褪黑素的含量会更低，那就更不能判断，因此不能满足检测的要求。血清素、组胺、多巴胺也有类似的问题存在，神经递质因为其生物学特性的特殊性，对检测的灵敏度要求很高，之前的方法很难达到检测要求，因为其实际应用没有开展；3)褪黑素、血清素、组胺、多巴胺这些化合物是最关键的指标，临床上要求一起检测，单独检测这些化合物是相对容易的，每种化合物都可以挑选最适合他们的方法，以提高灵敏度为目标进行大量的针对性的优化。但是遗憾的是，如果单独检测这些化合物，就会造成临床报告时间“tat”大大增加，"tat"(turnaround time)表示从收到样本到发出报告所需的时间，这些化合物的tat要求很高，因为这些化合物在体内变化很快，必须要尽快检测，多次检测完全不能满足临床tat的要求。

4、除了褪黑素以外，其他化合物的logp都很低甚至是负值，这样的特点决定了他们不能被常规的lle或者spe所萃取。

5、 名称 logp(亲脂性) 褪黑素 1.48 血清素 -0.36 组胺 -0.57 多巴胺 -0.61

6、褪黑素、血清素、组胺、多巴胺结构式如下：

7、

8、曾经有报道采用苯甲酰氯进行衍生的反应，但是一体化衍生与固相萃取的连续反应平台同时测定褪黑素、血清素、组胺、多巴胺等神经递质，未见任何公开报道。

9、经对现有专利文献检索发现，cn201510076850.4公开了一种生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的前处理方法，包括将含有生物原胺类神经递质和/或其代谢产物的样品衍生化，对衍生化产物在线固相萃取；其中，衍生化试剂的结构含有与芳环连接的磺酰氯基或酰氯基；生物原胺类神经递质或其代谢产物为多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素、5-羟色胺和犬尿氨酸中的一种或多种。该专利采用的衍生反应全部需要37℃，不能在室温下进行，按照该专利中的描述具体为37℃，反应40min(11页，其余的实施例均同实施例1)。非室温反应特别是这么长的反应时间远远不能满足临床的要求，会让报告时间大大延长，而且不能用于临时样品的检测。并且，该专利中，在非室温而且这么长的反应时间下，检测的灵敏度依然没有达到临床检测的要求，例如多巴胺的健康人水平是在30pg/ml以下，很多人都在10pg/ml上下，而该专利中的线性范围1-1000ng/ml，意味着线性只能覆盖到最低1ng/ml，即1000pg/ml,距离临床检测要求在10pg/ml相差了100倍。进一步，褪黑素在健康人体内含量很低，很多人都在5pg/ml以下，因此需要检测到1-2pg/ml的浓度才能满足临床的要求，该专利的褪黑素在实施例3和实施例4中出现，线性范围都是1-1000ng/ml，意味着线性只能覆盖到最低1ng/ml，即1000pg/ml，距离临床的检测要求相差了1000倍。

10、cn202010327051.0公开了一种血清中激素和神经递质的检测方法；其中，多巴胺的定量限为0.23ng/ml，即230pg/ml，距离临床检测要求的10pg/ml相差很远，同样的，褪黑素的定量限为0.06ng/ml即60pg/ml，距离临床检测要求的1pg/ml仍然相差很远。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供基于一体化衍生与固相萃取连续反应平台的神经递质检测方法，尤其涉及一种基于一体化衍生与固相萃取的连续反应平台的高灵敏度的同时检测褪黑素、血清素、组胺和多巴胺的方法。本发明通过流程的设计形成一体化衍生与固相萃取的连续反应平台，实现了褪黑素、血清素、组胺、多巴胺的高灵敏度的同时检测，实现了褪黑素1pg/ml、血清素1ng/ml、组胺0.03ng/ml、多巴胺10pg/ml的检测灵敏度。

2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

3、本发明提供一种基于一体化衍生与固相萃取连续反应平台的神经递质检测方法，所述神经递质至少包括两类：a类神经递质无伯胺基团、羟基基团、羧基基团；b类神经递质含有伯胺基团、羟基基团和羧基基团中的至少一种；

4、检测前采用含苯甲酰氯的水相衍生体系对血浆或血清样品中的神经递质进行衍生化处理，所得上清液中加入甲酸水溶液混匀、离心，所得上清液经固相萃取后进行lc-ms分析。

5、作为本发明的一个实施方案，所述a类神经递质包括褪黑素；所述b类神经递质包括血清素、组胺、多巴胺、γ-氨基丁酸、谷氨酰胺、5-羟基吲哚-3-乙酸、左旋多巴、犬尿氨酸、色胺、谷氨酸、色氨酸中至少一种。

6、作为本发明的一个实施方案，所述神经递质包括褪黑素、血清素、组胺、多巴胺。

7、作为本发明的一个实施方案，所述衍生化处理包括如下步骤：

8、a1、取血浆或血清样品，加入内标溶液、硫酸锌水溶液，混匀离心取上清液；

9、a2、加入碳酸钠水溶液混匀；

10、a3、继续加入苯甲酰氯的乙腈溶液，混匀离心。

11、作为本发明的一个实施方案，硫酸锌水溶液的浓度为100-300mm；

12、和/或，碳酸钠水溶液浓度为1000mm-2000mm；

13、和/或，苯甲酰氯的乙腈溶液的浓度为10％-20％。

14、作为本发明的一个实施方案，样品与硫酸锌水溶液的体积比为100:100-400；

15、和/或，样品与碳酸钠水溶液的体积比为100:50-100；

16、和/或，样品与苯甲酰氯的乙腈溶液的体积比为100:20-100。

17、作为本发明的一个实施方案，混匀离心是涡旋混匀(转速1000-1500转)，高速离心(14,000rpm，4℃)。

18、作为本发明的一个实施方案，所述内标溶液中内标选用神经递质的同位素内标。

19、样品与内标溶液的体积比为100:10-50。作为本发明的一个实施方案，所述内标溶液中含褪黑素、血清素、组胺、多巴胺的同位素内标，浓度分别为0.05-0.5ng/ml、50

20、-500ng/ml、1.5 -15ng/ml、0.5-5ng/ml。在一些具体实施例中，选择内标溶液中含褪黑素、血清素、组胺、多巴胺的同位素内标褪黑素-d4、5-羟基色胺-d4、组胺-d4、多巴胺-d4，浓度分别为0.05ng/ml、50ng/ml、1.5ng/ml、0.5ng/ml。

21、作为本发明的一个实施方案，甲酸水溶液浓度为1m-3m。

22、作为本发明的一个实施方案，样品与甲酸水溶液的体积比为100:30-100。

23、作为本发明的一个实施方案，所述固相萃取是将所得上清液上样于c18基质的spe板，淋洗后，加入乙腈洗脱。

24、作为本发明的一个实施方案，上清液上样量为180-380微升；和/或，加入100-200微升的90-100％乙腈洗脱。

25、作为本发明的一个实施方案，结合lc-ms分析，基于基于标准曲线法计算样品中神经递质的含量。

26、在一些实施示例中，lc-ms分析时，液相条件如下：

27、色谱条件：

28、流动相a相：甲醇

29、流动相b相：0.1％甲酸水溶液

30、梯度条件：

31、 时间/分钟 a相/％ b相/％ 梯度曲线 0 98 5 / 9.9 5 95 6 10.0 0 100 6 11.0 0 100 6 12.0 98 5 1

32、。

33、在一些实施示例中，lc-ms分析时，质谱条件如下：

34、

35、需要说明的是，本发明实施例中只是选择了褪黑素、血清素、组胺、多巴胺展示一体化衍生与固相萃取的连续反应平台用于高灵敏度同时检测该类型化合物，一样的方法可以用于其他类似化合物的检测，包括但不限于γ-氨基丁酸、谷氨酰胺、5-羟基吲哚-3-乙酸、左旋多巴、犬尿氨酸、色胺、谷氨酸、色氨酸等。

36、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

37、1)通过流程的设计形成一体化衍生与固相萃取的连续反应平台，实现了褪黑素、血清素、组胺、多巴胺的高灵敏度的同时检测，实现了褪黑素1pg/ml、血清素1ng/ml、组胺0.03ng/ml、多巴胺10pg/ml的检测灵敏度。

38、2)选择可以在室温下快速反应的特定的衍生化试剂，首先通过衍生化的方法来提高血清素、组胺、多巴胺的检测灵敏度。

39、3)改变了传统的衍生化体系，用来为血清素、组胺、多巴胺接入非极性基团(苯甲酰基团)，传统的衍生化体系的反应环境是有机相为主体的反应体系，有机相为主体的体系造成后面的步骤中褪黑素等化合物严重丢失，改变衍生化体系从有机相体系到水相体系使得褪黑素、血清素、组胺、多巴胺都大大提高了检测的灵敏度。

40、4)改变了传统的衍生化体系结束时的高ph值和高离子强度，传统的衍生化体系结束时是高ph环境和高离子强度，高ph环境和高离子强度在后面的步骤中都会影响了褪黑素、血清素、组胺、多巴胺的检测灵敏度，通过加入试剂调整到了最佳的ph值同时降低了离子强度后，结合spe大大地提高了灵敏度。

41、5)通过在结构上接入大量非极性基团，并配合了适合的衍生化体系和spe上样前的体系后，改变了血清素、组胺、多巴胺不能被保留在c18基质的spe上的缺点，使这些化合物可以很好的保留在c18基质的spe上。衍生化和spe这2种提高灵敏度和纯化的技术联合后，使得褪黑素、血清素、组胺、多巴胺能获得了超高的灵敏度。

42、6)一体化衍生与固相萃取的连续反应平台的设计，使得衍生化和spe可以一锅完成，只需要加入各种不同的试剂即可，过程中间不需要吹干、不需要液液萃取、不需要脱盐等，实现了一份样品一锅法高灵敏度测定褪黑素、血清素、组胺、多巴胺。